披露了源自CHO细胞的重组人α葡糖苷酶(rhGAA)组合物，该组合物包含更优化的聚糖组合物，该聚糖组合物由rhGAA和在复合寡糖上的低量的末端半乳糖组成，该rhGAA比常规rhGAA更高量、包含携带甘露糖‑6‑磷酸(M6P)或双‑M6P的N‑聚糖，连同低量的非磷酸化的高甘露糖聚糖。描述了包含该rhGAA的组合物以及使用方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有增强的碳水化合物的高强度酸性Α-葡糖苷酶相关申请的交叉引用本申请要求2014年9月30日提交的美国临时62/057,842、2014年9月30日提交的美国临时62/057,847、2015年2月5日提交的美国临时62/112,463、以及2015年3月19日提交的美国临时62/135,345的优先权的权益，其中每个通过引用以其全部内容结合。专利技术背景专利
本专利技术涉及医学、遗传学和重组糖蛋白生物化学领域，并且具体地涉及重组人α葡糖苷酶(rhGAA)组合物，这些组合物具有较高总含量的带有甘露糖6-磷酸的聚糖，这些聚糖有效靶向肌细胞上的CIMPR并随后将rhGAA递送至溶酶体，在该溶酶体中该rhGAA可分解异常高水平的累积的糖原。与常规rhGAA产品相比，本专利技术的rhGAA表现出优秀的对肌细胞的靶向和随后向溶酶体的递送，并且表现出使其对患有庞贝氏病(Pompedisease)的受试者的酶替代疗法特别有效的其他药代动力学性质。相关技术说明针对庞贝氏病的现有酶替代疗法使用常规rhGAA产品，这些常规rhGAA产品具有低总含量的带有M6P和双-M6P的聚糖。已知和阿葡糖苷酶α名下的常规产品。“Lumizyme”和“Myozyme”是由健赞公司(Genzyme)作为生物制剂生产或销售的且由美国食品和药物管理局批准的常规形式的rhGAA，并且该“Lumizyme”和“Myozyme”通过参考医生案头参考(Physician’sDeskReference)(2014)(其通过引用结合在此)或由FDA于2014年10月1日批准在美国使用的名为或的产品来描述。阿葡糖苷酶α被鉴定为化学名称[199-精氨酸,223-组氨酸]前原-α-葡糖苷酶(人)；分子式：C4758H7262N1274O1369S35；CAS号420794-05-0。将这些产品给予于患有庞贝氏病(又称糖原贮积症II型(GSD-II)或酸性麦芽糖酶缺乏症)的受试者。酶替代疗法寻求通过给予rhGAA替换溶酶体中缺失的GAA，从而恢复细胞分解溶酶体糖原的能力来治疗庞贝氏病。庞贝氏病是由于酸性α-葡糖苷酶(GAA)活性缺乏导致的遗传性溶酶体贮积症。患有庞贝氏病的人没有或具有降低水平的酸性α-葡糖苷酶(GAA)，该酶分解糖原和身体用作能量源的物质。这种酶缺乏导致溶酶体中过量的糖原累积，这些溶酶体是包含通常分解糖原和其他细胞碎片或废物的酶的内细胞器。患有庞贝氏病的受试者的某些组织(尤其是肌肉)中的糖原累积损害了细胞正常运行的能力。在庞贝氏病中，在溶酶体中，特别是在骨骼肌细胞中，糖原没有适当地代谢并逐渐累积，并且在该疾病的婴儿发病形式中，在心肌细胞中，糖原没有适当地代谢并逐渐累积。糖原的积累损害肌细胞和神经细胞以及其他受影响的组织中的那些肌细胞和神经细胞。传统上，取决于发病年龄，庞贝氏病在临床上被确认为是早期婴儿形式或晚期发病形式。发病年龄倾向于与导致庞贝氏病的遗传突变的严重性相应。最严重的基因突变导致GAA活性的完全丧失，显现为婴儿期的早发性疾病。减少GAA活性但不完全消除GAA活性的遗传突变与具有延迟发病和进展的庞贝氏病的形式相关。婴儿发病的庞贝氏病在出生后不久显现，并且其表征为肌无力、呼吸功能不全和心力衰竭。未经治疗，它通常在两年内是致命的。儿童和成人发病的庞贝氏病在生命晚期显现，并且通常进展比婴儿发病更慢。这种形式的疾病，虽然它通常不影响心脏，但由于骨骼肌和参与呼吸的那些肌肉的弱化，也可以导致死亡。当前庞贝氏病的非姑息治疗涉及使用重组人GAA(rhGAA)如或的酶替代疗法(ERT)。给予rhGAA以试图在患有庞贝氏病的受试者中替换或补充缺失的或缺乏的GAA。然而，由于常规rhGAA产品中的大多数rhGAA不靶向肌肉组织，因此在给予后其被非生产性地消除。发生这种状况是因为常规rhGAA缺乏高总含量的带有M6P和双-M6P的聚糖，这些聚糖将rhGAA分子靶向靶肌细胞上的CIMPR，随后在这些靶肌细胞中将该rhGAA转运到细胞的溶酶体中。这种用于酶替代疗法的rhGAA的细胞摄取通过专门的碳水化合物(甘露糖-6-磷酸(M6P))进行促进，该M6P结合至存在于细胞表面上的阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体(CIMPR)，用于随后将外源酶递送至溶酶体。在rhGAA上存在七个潜在的N-联糖基化位点。由于每个糖基化位点在存在的N-联寡糖(N-聚糖)的类型中是异质的，所以rhGAA由具有N-聚糖的蛋白的复杂混合物组成，这些N-聚糖对M6P受体和其他碳水化合物受体具有不同结合亲和力。包含具有一个M6P基团(单-M6P)的高甘露糖N-聚糖的rhGAA以低(约6,000nM)亲和力结合至CIMPR，而在相同N-聚糖上包含两个M6P基团(双-M6P)的rhGAA以高(约2nM)亲和力来结合。非磷酸化的、单-M6P、和双-M6P聚糖的代表性结构如图1A所示。甘露糖-6-P基团如图1B所示。一旦在溶酶体内，rhGAA可以酶促降解累积的糖原。然而，常规rhGAA具有低总水平的带有M6P和双-M6P的聚糖，并且因此靶向肌细胞很差，导致rhGAA至溶酶体的较差递送。这些常规产品中的大多数rhGAA分子不具有磷酸化的N-聚糖，从而缺乏对CIMPR的亲和力。非磷酸化的高甘露糖聚糖也可以被甘露糖受体清除，该甘露糖受体导致ERT的非生产性清除(图2)。包含半乳糖和唾液酸的其他类型的N-聚糖、复合碳水化合物，也存在于rhGAA上。由于复合的N-聚糖没有被磷酸化，所以它们对CIMPR没有亲和力。然而，具有暴露的半乳糖残基的复合型N-聚糖对肝脏肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体具有中度至高度亲和力，这导致rhGAA的快速非生产性清除(图2)。GAA或rhGAA的糖基化可以通过磷酸转移酶和坎菲尔德(Canfield)等人，美国专利号6,534,300所描述的揭酶(uncoveringenzyme)在体外进行酶促修饰以产生M6P基团。酶糖基化不能被充分控制，并且产生具有不期望的免疫学性质和药理学性质的rhGAA。酶促修饰的rhGAA可以仅包含高-甘露糖N-聚糖，这些高甘露糖N-聚糖全部可以用磷酸转移酶/揭酶在体外潜在地进行酶促磷酸化，并且可以每个GAA包含平均5-6个M6P基团。通过对GAA进行体外酶处理而产生的糖基化模式是有问题的，因为额外的末端甘露糖残基，特别是非磷酸化的末端甘露糖残基负面影响经修饰的rhGAA的药代动力学。当在体内给予此类酶促修饰的产物时，这些甘露糖基团增加了GAA的非生产性清除，增加了免疫细胞对酶促修饰的GAA的摄取，并且由于更少的GAA到达靶组织(如心肌细胞或骨骼肌肌细胞)而降低了rhGAA治疗功效。例如，末端非磷酸化甘露糖残基是肝和脾中的甘露糖受体的已知配体，其导致酶促修饰的rhGAA的快速清除和rhGAA对靶组织的靶向降低。此外，具有含末端非磷酸化甘露糖残基的高甘露糖N-聚糖的酶促修饰的GAA的糖基化模式类似于酵母、霉菌和功能中产生的糖蛋白上的糖基化模式，这些酵母、霉菌和功能增加了引发对酶促修饰的rhGAA的免疫或过敏反应(如危及生命的严重过敏(过敏性)或超敏反应)的风险。如上所解释的，常规rhGAA产品如具有低水平的单磷酸化聚糖和甚至更低的双磷酸化聚糖。为了使庞贝氏病疗法有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种源自CHO细胞的rhGAA组合物，该rhGAA组合物包含比通过
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.30 US 62/057,842;2014.09.30 US 62/057,847;1.一种源自CHO细胞的rhGAA组合物，该rhGAA组合物包含比通过(阿葡糖苷酶α；CAS420794-05-0)所例示的常规rhGAA更高量的rhGAA，该更高量的rhGAA包含携带单-甘露糖-6-磷酸(M6P)或双-M6P的N-聚糖。2.如权利要求1所述的rhGAA组合物，其中该rhGAA包括与通过SEQIDNO:1所述的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的rhGAA组合物，其中30％或更多的rhGAA结合至阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)，或者30％或更多的rhGAA包含携带单-M6P或双-M6P的N-聚糖。4.如权利要求1所述的rhGAA组合物，其中50％或更多的rhGAA结合至阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)，或者50％或更多的rhGAA包含携带单-M6P或双-M6P的N-聚糖。5.如权利要求1所述的rhGAA组合物，其中90％至100％的rhGAA结合至阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)，或者90％至100％或更多的rhGAA包含携带单-M6P或双-M6P的N-聚糖。6.如权利要求1所述的rhGAA组合物，其中携带M6P的N-聚糖的平均含量范围是从0.5至7.0mol/molrhGAA。7.如权利要求1所述的rhGAA组合物，其中携带M6P的N-聚糖的平均含量范围是从1.0至4.0mol/molrhGAA。8.如权利要求1所述的rhGAA组合物，其中携带M6P的N-聚糖的平均含量范围是从5.0至6.0mol/molrhGAA。9.如权利要求1所述的rhGAA组合物，其中平均来说，这些N-聚糖包含大于3mol/mol的M6P和大于4mol/mol的唾液酸。10.如权利要求1所述的rhGAA组合物，其中平均来说，该rhGAA上的40％至60％的N-聚糖是复合型N-聚糖；其中该rhGAA上的不超过6.5％的N-聚糖是杂合型N-聚糖，并且其中该rhGAA上的不超过15％的高甘露糖型N-聚糖是非磷酸化的，该rhGAA上的至少10％的高甘露糖型N-聚糖是单-M6P磷酸化的，和/或该rhGAA上的至少2％的高甘露糖型N-聚糖是双-M6P磷酸化的。11.如权利要求1所述的组合物，其中该...
【专利技术属性】
技术研发人员：拉塞尔·戈乔尔，H·杜，
申请(专利权)人：阿米库斯治疗学公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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