由干细胞分化肝细胞样细胞制造技术

公开了分化干细胞以便获得肝细胞样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a)使定形内胚层经受至少一种表观遗传调节剂以获得成肝细胞，和b)使所述成肝细胞经受至少一种干细胞分化通路抑制剂以获得肝细胞样细胞；其中步骤a)和b)不包括使用生长因子。在一个优选实施方案中，所述表观遗传调节剂可以是丁酸钠和/或DMSO，并且所述干细胞分化通路抑制剂可以是SB431542和/或DMSO。还公开了由所述方法获得的肝细胞样细胞和这些细胞的用途诸如药物筛选。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由干细胞分化肝细胞样细胞对相关申请的交叉引用本申请要求于2014年9月19日提交的新加坡临时申请号10201405916Y的优先权权益，该申请的全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
本专利技术涉及发育生物学。具体地，本专利技术还涉及用于将干细胞分化成更多个肝细胞样细胞的组合物。本专利技术还涉及使用本专利技术的组合物将干细胞分化成更多个肝细胞样细胞的方法。
技术介绍
人肝细胞是用于肝毒性筛选的有价值工具，所述肝毒性筛选是用于药物发现和开发的关键步骤。另外，肝细胞移植已经证明是原位肝移植的有前途的替代方式。目前选择用于药物筛选和细胞治疗的细胞系统是原代人肝细胞(PH)。然而，原代人肝细胞在临床或药学应用中的效用受它们的可用性、供体变异性、受限的增殖和在延长的培养期内功能衰退的限制。因此，已经将大量努力致力于衍生出功能性肝细胞的可替代的可扩充来源，所述可替代的可扩充来源可以克服与原代人肝细胞相关的缺点。人胚胎干细胞(hESC)由于它们的不受限制的增殖和多能性分化能力而提供了原代人肝细胞的有吸引力的可替代细胞来源。因此，需要用于获得和维持表现成人肝细胞表型的肝细胞样细胞的方法。
技术实现思路
在一个方面，提供了使定形内胚层分化以便获得肝细胞样细胞的方法。在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：a)使定形内胚层经受至少一种表观遗传调节剂以获得成肝细胞，b)使所述成肝细胞经受至少一种干细胞分化通路抑制剂以获得肝细胞样细胞；其中步骤a)和b)不包括使用生长因子。在另一个方面，提供了通过如本文所述的方法获得的或通过如本文所述的方法能获得的肝细胞样细胞。还在另一个方面，提供了如本文所述的肝细胞样细胞在选自由下列各项组成的组的应用中的用途：药物毒性筛选、药物细胞毒性评估细胞治疗、组织工程和组织再生。附图说明当结合非限制性实施例和附图考虑时将参照详细说明来更好地理解本专利技术，在附图中：图1示出了阐明用来使人胚胎干细胞(hESC)分化成肝细胞的三步骤方案的示意性图示。左列示出了如本文所述的方案的实施例。右列阐明了如本领域中所公知的基于生长因子的方案。如本领域中所公知的基于生长因子的方案用作用于分析用小分子代替生长因子的作用的对照。图2示出了条形图，所述条形图阐明了激活素A和Wnt3a替换对定形内胚层诱导的qPCR分析的结果。在用不同组合中的小分子或用生长因子处理6天的人胚胎干细胞(hESC)中多能性标志物OCT4(A)和定形内胚层标志物FoxA2和SOX17(B)的表达。*A和B中的第一个条表示在第0天时的标志物表达。第二个条表示在不利用任何小分子或生长因子处理的条件下在第6天时的标志物表达(用DMSO作为小分子的媒介物对照处理细胞)。(C)与用激活素A和Wnt3a处理的人胚胎干细胞(hESC)相比，HNF4α、多能性标志物OCT4、Nanog和SOX2以及定形内胚层标志物FoxA2和SOX17在用激活素和小分子的组合处理的hESC中的表达(灰色条)。(D)利用与表观遗传调节剂组合的不同小分子处理的第6天分化的细胞的基因表达。表达水平与生长因子分化的细胞(深灰色条)和用生长因子、小分子和表观遗传调节剂分化的细胞(具有白色圆点的浅灰色条)相比较。结果相对于GAPDH作图。条示出平均值±s.d(n＝3)。在图2中，“NaBu”是指丁酸钠；“LY”是指LY294002；“Act”是指激活素A；“GAPDH”是指甘油醛3-磷酸脱氢酶。因此，图2示出了用小分子与激活素A组合处理导致诱导定形内胚层(DE)分化。图3示出了关于小分子是否有效地诱导由定形内胚层形成成肝细胞的分析中的结果。具体地，(A)示出了相衬图像，所述相衬图像示出了用小分子-丁酸钠和DMSO(上部图)诱导另外6天或用生长因子-FGF-2、BMP-4以及相继地用FGF-1、FGF-4和FGF-8(下部图)诱导8天的定形内胚层期中的细胞的形态学。比例尺:250μm；(B)示出了条形图，其显示qPCR分析结果，所述结果表明在用小分子或生长因子处理的细胞中定形内胚层标志物FoxA2和SOX17下调。FoxA2和SOX17的表达水平相对于第6天进行表示。条示出平均值±s.d(n＝3)；(C)示出了条形图，所述条形图描绘了示出肝标志物AFP、Alb和HNF4α、CK18以及胆标志物CK19的qPCR分析结果，确认在用小分子或生长因子处理的细胞中生成了成肝细胞。结果相对于GAPDH作图。条示出平均值±s.d(n＝3)。因此，图3表明在分化过程期间生成了成肝细胞以及基于小分子的诱导(方法如本文所述)与基于生长因子的诱导(方法如本领域所公知)相当。图4示出了条形图，所述条形图描绘了示出在(利用图1中所述的任一种方法培养的)20天分化期结束时肝标志物基因表达的qPCR分析结果。图4示出了使用小分子衍生于hESC的肝细胞的肝标志物的相对表达。结果相对于对照酶GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)作图。在生成成肝细胞(图3)后，细胞用SB431542/DMSO处理8天(标记为基于小分子的成熟)或用HGF和卵泡抑素处理6天(标记为基于生长因子的成熟)。用于基于小分子的方式和基于生长因子的方式两者的分化的总时间周期为20天(图1)。条示出平均值±s.d(n＝3)。因此，图4表明由如图1中所示的任一种方法获得的肝细胞产生相似的肝标志物曲线。图5表明使用小分子(SM-Hep)和生长因子(GF-Hep)衍生于人胚胎干细胞(hESC)的肝细胞的功能性能。具体地，(A)示出了产生白蛋白的条形图；(B)示出了产生尿素的条形图；和(C)示出了使用小分子(SM-Hep)或生长因子(GF-Hep)获自hESC的肝细胞产生CYP1A2和CYp3A4特异性代谢物的条形图。简言之，使用小分子或生长因子分化细胞20天，然后在第20天时收集上清液用于测量白蛋白和尿素的产生。分化的细胞用CYP1A2和CYp3A4特异性底物处理用于量化代谢物的产生。产生的白蛋白、尿素和代谢物的量相对于细胞数目归一化。条示出平均值±s.d(n＝3)。因此，图5示出了由如图1中所示的任一种方法获得的肝细胞可以产生白蛋白、尿素以及CYP1A2和CYp3A4。图6示出了描绘在用药物处理后细胞活力百分比的图。图6示出了由如本文所述的分化方法获得的细胞在药物测试中应用实施例的结果。小分子(SM-Hep)、生长因子(GF-Hep)和原代人肝细胞(PH)的细胞活力在暴露于不同浓度的测试化合物24小时后通过MTS细胞活力测定进行评估。细胞活力表示为仅用溶剂处理的细胞的百分比。条示出平均值±s.d(n＝3)。因此，图6表明小分子来源的肝细胞(SM-Hep)的敏感性类似于生长因子来源的(GF-Hep)肝细胞的敏感性。图7示出了如本文所述的方法中各个步骤的通用示意性图示。具体地，(A)示出了干细胞分化成定形内胚层；(B)示出了定形内胚层分化成成肝细胞/肝祖细胞；和(C)示出了肝祖细胞/成肝细胞分化成成熟的肝细胞或肝细胞样细胞。图8示出了qPCR分析的结果，其示出了激活素A和Wnt3a替换对诱导定形内胚层的作用。具体地，(A)示出了与用激活素A和Wnt3a处理的hESC(深灰色条)相比，多能性标志物OCT4、Nanog和SOX2和定形内胚层标志物FOXA2和SOX17在用激活素和小分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分化定形内胚层以便获得肝细胞样细胞的方法，其中所述方法包括：a)使定形内胚层经受至少一种表观遗传调节剂以获得成肝细胞，b)使所述成肝细胞经受至少一种干细胞分化通路抑制剂以获得肝细胞样细胞；其中步骤a)和b)不包括使用生长因子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.19 SG 10201405916Y1.一种分化定形内胚层以便获得肝细胞样细胞的方法，其中所述方法包括：a)使定形内胚层经受至少一种表观遗传调节剂以获得成肝细胞，b)使所述成肝细胞经受至少一种干细胞分化通路抑制剂以获得肝细胞样细胞；其中步骤a)和b)不包括使用生长因子。2.权利要求1所述的方法，其中在步骤a)之前，所述定形内胚层通过使干细胞经受至少一种通过抑制激酶活性来调节干细胞分化的化合物获得。3.权利要求2所述的方法，进一步包括生长因子用于获得定形内胚层。4.权利要求3所述的方法，其中所述生长因子是激活素，诸如激活素A、激活素AB或激活素B。5.权利要求2所述的方法，其中使用至少两种通过抑制激酶活性来调节干细胞分化的化合物来获得定形内胚层,其中一种通过抑制激酶活性来调节干细胞分化的化合物是磷酸肌醇-3-激酶抑制剂。6.权利要求5所述的方法，其中使用所述至少两种通过抑制激酶活性来调节干细胞分化的化合物来获得定形内胚层,其中一种化合物是糖原合成酶3抑制剂。7.权利要求5所述的方法，其中使用至少两种通过抑制激酶活性来调节干细胞分化的化合物来获得定形内胚层,其中一种化合物是磷酸肌醇-3-激酶抑制剂，第二种化合物是糖原合成酶-3-抑制剂。8.权利要求2中任一项所述的方法，其中所述通过抑制激酶活性来调节干细胞分化的化合物作用于转化生长因子β(TGF-β)家族/SMAD信号传导通路/激活素和Wnt信号传导通路/磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)-AKT信号传导通路。9.权利要求2-8中任一项所述的方法，其中所述通过抑制激酶活性来调节干细胞分化的化合物选自由下列各项组成的组：2-吗啉-4-基-8-苯基苯丙吡喃-4-酮(LY294002)、(1α,11α)-11-(乙酰氧基)-1-(甲氧基甲基)-2-氧杂雄甾-5,8-二烯(6,5,4-bc)呋喃-3,7,17-三酮(渥曼青霉素)、(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯-1-基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX-866)、(8S,14S,17S)-14-(羧甲基)-8-(3-胍基丙基)-17-(羟基甲基)-3,6,9,12,15-戊氧代-1-(4-(4-氧-8-苯基-4H-色烯-2-基)吗啉代-4-)-2-氧杂-7,10,13,16-四氮杂十八烷-18-酸盐(SF1126)、3-[4-(4-吗啉基)吡啶并[3’,2’:4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]-苯酚(PI-103)、2-(1H-吲唑-4-基)-6-(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基甲基)-4-吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]...

【专利技术属性】
技术研发人员：余严军，D·潘，YC·卓，F·塔斯尼姆，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG