囊泡靶向蛋白及其用途制造技术

本披露提供了一种治疗遗传障碍的新方法，其中肽序列使通过基因疗法产生的蛋白靶向至外泌体中。加载有这些蛋白的外泌体可以进入非转导细胞并校正病理。此外，还披露了基因疗法组合物、蛋白替代疗法组合物、药物组合物、治疗方法以及这些基因疗法组合物和这些重组蛋白的用途。所述方法还可用于改善体外重组蛋白产率。率。率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】囊泡靶向蛋白及其用途


[0001]本披露总体上涉及基因疗法和治疗遗传障碍。

技术介绍

[0002]核酸通常用于基因疗法以替代无功能基因和中和致病突变，并且可以RNA的形式，包括干扰(RNAi)效应分子和DNA。尽管有这种效用，但由于快速清除、核酸酶、缺乏器官特异性分布和细胞摄取效率低等原因，已知裸露的DNA和RNA难以在体内递送；因此，通常使用专门的基因递送媒剂进行传递。病毒载体和阳离子脂质体也被开发为递送媒剂。
[0003]尽管有这些现有技术，但仍然存在限制基因疗法的重大局限性，包括对大多数病毒载体的免疫识别和对病毒例如慢病毒的诱变整合；和炎症毒性以及脂质体的快速清除。先天免疫系统的识别会导致急性炎症反应，这可能需要使用免疫抑制策略来克服当前策略的摄取和重新施用问题，这些问题可能会使患者面临不必要的机会性感染风险。针对递送媒剂产生的抗体也显著降低了后续施用的转基因表达。
[0004]特别是，腺相关病毒(AAV)载体是一种已用于递送转基因以进行基因疗法的载体。AAV是细小病毒科、细小病毒亚科、依赖病毒属、腺相关病毒种的辅助依赖性病毒。它需要辅助病毒进行复制，因此自然感染是在感染辅助病毒(如腺病毒)的情况下发生的。AAV载体是可扩展的、高效的、无细胞病变的基因递送媒剂，主要用于治疗遗传疾病。几种基于AAV的基因转移产品目前正在针对多种适应症进行临床测试，在某些情况下，临床开发接近后期阶段并获得许可，包括美国FDA批准voretigene neparvovec(Luxturna)，一种新基因疗法，用于治疗Leber氏先天性黑蒙的、。尽管基于AAV的基因治疗方法有望治疗多种障碍，但在暴露于腺相关病毒或AAV载体后会发生免疫反应，这些保护性反应可能会限制AAV载体的治疗功效。体液反应(抗AAV中和抗体或NAb)通常会引起病毒中和，导致靶细胞的病毒转导显著减少，从而限制递送的治疗性多肽的量。抗AAV中和抗体可高效中和AAV载体；这已经在人(Manno C.S.,等人,Nat Med.[自然医学]2006；12:342
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347)，小鼠(Scallan C.D.,等人,Blood.[血液]2006；107:1810
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1817)，和非人类灵长类动物(Jiang H.,等人,Blood.[血液]2006；108:3321
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3328)中报道。人也会自然地暴露于野生型AAV，因此他们会产生与所有AAV血清型发生交叉反应的抗体。
[0005]除了抗体反应外，暴露于AAV载体的个体可以产生特异性针对AAV载体衣壳的细胞毒性T细胞(CTL)反应(Li H.,等人,Nature.[自然]475,217
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221(2011)；Arruda V.R.,等人,Blood.[血液]115,4678
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4688(2010)；Chen Y.H.,等人,Nat.Med.[自然医学]15,1215
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1218(2009)；Boutin S.,等人,Hum.Gene.Ther.[人类基因疗法]21,704
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712(2010)；Calcedo R.,等人,J.Infect.Dis.[传染病杂志]199,381
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390(2009))。这些CTL反应负责清除AAV载体转导的细胞，从而导致有限的治疗功效。CTL反应以载体剂量依赖性方式触发(Li H.,等人,Nature.[自然]475,217
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221(2011)；Chen Y.H.,等人,Nat.Med.[自然医学]15,1215
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1218(2009)；Calcedo R.,等人,J.Infect.Dis.[传染病杂志]199,381
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390(2009))，因此强调了在较低载体剂量下实现高水平转导效率的重要性。
[0006]目前解决免疫反应相关问题的方法包括预先筛选个体并排除那些具有针对病毒衣壳的高效价中和抗体的个体。通过降低施用所需的病毒载量，对衣壳产生免疫反应的可能性就会降低。
[0007]与基因疗法相关的另一个挑战是靶组织的不完全校正。目前的方法不可能实现100％的病毒转导(至少一个载体拷贝/目的患病细胞)。通常，当用编码非分泌蛋白的基因进行转导时，疾病只会在少数能够接受并稳定表达AAV递送基因的细胞中得到改善。这导致呈马赛克图案的仅部分校正。理想情况下，整个患病组织都能够从转基因产品受益。
[0008]目前，最大化转导的唯一选择之一是增加病毒剂量以最大化病毒载体进入细胞的机会。这是有问题的，因为更高的剂量会导致更多的不良事件情况，包括严重的不良事件。
[0009]提高转导效率的另一种选择是选择更直接的施用途径。对于中枢神经系统(CNS)疾病，基因疗法载体被注入脑脊液(CSF)或通过各种途径直接注入脑，例如鞘内(IT)、颅内(IC)或小脑延髓池内(ICM)途径。这些施用途径与静脉内(IV)施用不同。静脉内递送比递送到CSF中更常规和更安全，并且不需要专门的医务人员来执行。然而，包括AAV在内的病毒载体不易穿过血脑屏障(BBB)，而是更容易转导肝脏和其他非CNS组织。
[0010]虽然基因递送技术有所改进，但仍然存在一些问题，包括一些可能无法转导的细胞(例如肌肉卫星细胞/干细胞)(Arnett等人2014Mol Therapy
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Methods&Clin Dev[分子疗法
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方法与临床开发]1:14038)。此外，在某些情况下，有效转导可能会受到疾病的负面影响，例如肌肉退化和纤维化。然而，随着越来越多的疾病被证明具有遗传成分，包括肥胖症、心脏病和精神疾病，为抢先式遗传解决方案修饰易感基因的潜力巨大，但前提是风险进一步降低并长期实现长期可持续性。因此，当务之急是开发能够避免免疫识别和炎症的技术，同时保持良好的递送效率，以便将基因疗法的应用扩展到致命疾病之外。

技术实现思路

[0011]本披露的一个方面涉及包含信号结构域和效应子结构域(ED)中的一个或多个的膜相关ED蛋白。在一些实施例中，信号结构域直接连接到效应子结构域。在一些实施例中，信号结构域通过至少第一接头肽连接到效应子结构域。在一些实施例中，信号结构域是豆蔻酰化信号结构域。
[0012]在膜相关ED蛋白的一个或多个实施例中，信号结构域氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159或SEQ ID NO:165具有至少70％序列相似性。在一个或多个实施例中，膜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:142具有至少70％序列相似性。9.如权利要求1所述的膜相关ED蛋白，其中所述膜相关ED蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:142具有至少90％序列相似性。
ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:142。18.如权利要求14所述的囊泡靶向蛋白，其中所述脂质缀合结构域包含一个或多个信号结构域，所述信号结构域包含豆蔻酰化信号结构域、棕榈酰化信号结构域、异戊二烯化信号结构域、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白和BiP分泌信号结构域中的一个或多个。19.如权利要求18所述的囊泡靶向蛋白，其中所述脂质缀合结构域是豆蔻酰化信号结构域。20.如权利要求18或19所述的囊泡靶向蛋白，其中所述信号结构域的氨基酸序列与MARCKS、MARCKSL1或BASP1蛋白家族的豆蔻酰化信号结构域具有至少70％的相似性。21.如权利要求18或19所述的囊泡靶向蛋白，其中所述信号结构域的氨基酸序列与MARCKS、MARCKSL1或BASP1蛋白家族的豆蔻酰化信号结构域具有至少90％的相似性。22.如权利要求18或19所述的囊泡靶向蛋白，其中所述信号结构域的氨基酸序列与MARCKS、MARCKSL1或BASP1蛋白家族的豆蔻酰化信号结构域具有100％的相似性。23.如权利要求19所述的囊泡靶向蛋白，其中所述信号结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159或SEQ ID NO:165具有至少70％序列相似性，条件是所述膜相关ED蛋白的所得氨基酸序列不是SEQ ID NO:38。24.如权利要求19所述的囊泡靶向蛋白，其中所述信号结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159或SEQ ID NO:165具有至
少90％序列相似性，条件是所述膜相关ED蛋白的所得氨基酸序列不是SEQ ID NO:38。25.如权利要求20所述的囊泡靶向蛋白，其中所述信号结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159或SEQ ID NO:165，条件是所述膜相关ED蛋白的所得氨基酸序列不是SEQ ID NO:38。26.如权利要求19
‑
25中任一项所述的囊泡靶向蛋白，其中所述ED结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少70％序列相似性，条件是所述膜相关ED蛋白的所得氨基酸序列不是SEQ ID NO:38。27.如权利要求19
‑
25中任一项所述的囊泡靶向蛋白，其中所述ED结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少90％序列相似性，条件是所述膜相关ED蛋白的所得氨基酸序列不是SEQ ID NO:38。28.如权利要求19
‑
25中任一项所述的囊泡靶向蛋白，其中所述ED结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30，条件是所述膜相关ED蛋白的所得氨基酸序列不是SEQ ID NO:38。29.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述囊泡靶向蛋白包含Nef蛋白或其变体。30.如权利要求14
‑
29中任一项所述的融合蛋白，其中所述囊泡靶向蛋白靶向外泌体和细胞外囊泡中的一个或多个。31.如权利要求14
‑
30中任一项所述的融合蛋白，其中所述目的蛋白是治疗性蛋白。32.如权利要求31所述的融合蛋白，其中所述治疗性蛋白包含溶酶体蛋白。33.如权利要求31所述的融合蛋白，其中所述治疗性蛋白包含CDKL5、α
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
己糖胺酶、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶、β
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葡萄糖脑苷脂酶、葡萄糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性鞘磷脂酶、甲酰甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶、乙酰辅酶A：α
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氨基葡糖苷N
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乙酰转移酶、糖胺聚糖α
‑
L
‑
艾杜糖醛酸水解酶、乙酰肝素N
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硫酸酯酶、N
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乙酰基
‑
α
‑
D
‑
氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶、半乳糖胺
‑6‑
硫酸硫酸酯酶、N

【专利技术属性】
技术研发人员：约瑟夫，
申请(专利权)人：阿米库斯治疗学公司，
类型：发明
国别省市：