编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的T淋巴细胞制造技术

编码一种表达于人T细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别人表皮生长因子受体EGFR的第287‑302位氨基酸表位的单链抗体scFv(EGFR)。

【技术实现步骤摘要】
编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的T淋巴细胞
本申请为CN201310108532.2的分案申请，原申请的申请日为2013年04月01日，专利技术名称为“编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的T淋巴细胞”。本专利技术涉及肿瘤细胞治疗领域，更具体地，涉及对表达EGFRvIII或高表达EGFR的上皮来源的肿瘤的转基因T淋巴细胞治疗领域。
技术介绍
表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)是一种跨膜糖蛋白，分子量为170KD，是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，广泛分布于人体各组织的细胞膜上[AlanWells.MoleculesinfocusEGFreceptor.IntJBiochemCellBiol,1999,31:637-643.]。其在大多数肿瘤中(如非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌，乳腺癌、头颈部鳞癌、胶质细胞瘤、胰腺癌、食管癌、胃癌、前列腺癌等)过表达和(或)突变，与肿瘤的发生发展、恶性变、转移及预后密切相关[JoseB.Whytheepidermalgrowthfactorreceptor？Therationalforcancertherapy[J].Oncologist,2002,7(4):2-8.]。因此，EGFR是肿瘤治疗的一个重要靶点。另外，研究表明EGFR287-302表位仅在EGFRvIII或过表达EGFR的肿瘤中才暴露，而在正常组织中该表位隐匿[GanHK,et.al.Targetingofaconformationallyexposed,tumor-specificepitopeofEGFRasastrategyforcancertherapy.CancerRes,2012,72(12):2924-2930.]。提示EGFR287-302表位是靶向EGFR的相关肿瘤治疗的一个理想位点。针对EGFR287-302表位的抗体已经被开发，其显示良好的肿瘤特异性杀伤作用。但抗体治疗存在着抗体在体内血液循环中半衰期的限制，一般来说，半衰期大多在23天以内。因此，持续给药和/或增大给药剂量是肿瘤抗体治疗所要求的，这导致患者治疗成本的增加，以及某些情况下甚至不得已终结治疗。另外，治疗性抗体作为异源蛋白，还有可能在体内产生过敏反应及针对该治疗性抗体的中和性抗抗体的风险。T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于T淋巴细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的上述缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意[GruppSA,et.al.Adoptivecellulartherapy.CurrTopMicrobiolImmunol.2011,344:149-72.]。近年来，根据细胞毒性T淋巴细胞对靶细胞的识别特异性依赖于T细胞受体(TCellReceptor,TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor,CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T细胞表面。这种CART细胞能够以主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibilityComplex,MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞重新定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。CART细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略[SchmitzM,et.al.Chimericantigenreceptor-engineeredTcellsforiImmunotherapyofCancer.JBiomedBiotechnol,2010,doi:10.1155/2010/956304.]。嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)如CD3ζ(即CD3zeta，简称Z)或FcεRIγ及共刺激信号分子CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CART细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3ζ。该种CART细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[ZhangT.et.al.ChimericNKG2D-modifiedTcellsinhibitsystemicT-celllymphomagrowthinamannerinvolvingmultiplecytokinesandcytotoxicpathways,CancerRes2007,67(22):11029–11036.]。随后发展的第二代CART细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T细胞的持续增殖，并能够提高T细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CART在体内的存活周期和抗肿瘤效果[DottiG.et.al.CD28costimulationimprovesexpansionandpersistenceofchimericantigenreceptormodifiedTcellsinlymphomapatients.JClinInvest,2011,121(5):1822-1826.]。近些年发展的第三代CART细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CART在体内的存活周期和其抗肿瘤效果[CarpenitoC.,etal.ControloflargeestablishedtumorxenograftswithgeneticallyretargetedhumanTcellscontainingCD28andCD137domains.PNAS,2009,106(9):3360–3365.]。尽管CART细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但一些潜在的风险亦需要考虑。比如，由于某些/种正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CART细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。如，针对肾细胞癌患者肿瘤细胞上表达的抗原碳酸酐酶IX(CAIX)是第一个用于临床的CART细胞过继治疗的案例，也是第一个报道含CAR细胞的脱靶效应的案例。病人在多次输入CART细胞后出现2-4级肝毒性。分析原因为肝胆管上皮细胞低表达CAIX，原临床试验被迫中断同时排除了病人治疗效果的任何评价。.[StoterG.etal.TreatmentofmetastaticrenalcellcarcinomawithautologousT-lymphocytesgenetical本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码一种表达于人T细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别人表皮生长因子受体EGFR的第287‑302位氨基酸表位的单链抗体scFv(EGFR)。

【技术特征摘要】
1.编码一种表达于人T细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别人表皮生长因子受体EGFR的第287-302位氨基酸表位的单链抗体scFv(EGFR)。2.如权利要求1所述的核酸，其中跨膜区选自包含CD8或CD28的跨膜区和铰链区的序列。3.如权利要求1或2所述的核酸，其中胞内信号区选自CD3ζ，FcεRIγ，CD28，CD137，CD134的胞内信号区序列，及其组合。4.如权利要求3所述的核酸，其中所述嵌合抗原受体蛋白是选自包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区的如下的嵌合抗原受体蛋白：scFv(EGFR)-CD8-CD3ζ，scFv(EGFR)-CD8-CD137-CD3ζ，scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD3ζ，scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD137-CD3ζ，及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中的第一个CD28代表其跨膜区，第二个CD28代表其胞内信号区。5.如权利要求1-4任一所述的核酸，所述核酸选自编码具有SEQIDNO:31～34之一序列的嵌合抗原受体蛋白的核酸。6.如权利要求1-4任一所述的核酸，所述核酸编码与SEQIDNO:31～34所示的序列竞争结合EGFR的第287-302位的氨基酸序列。7.如权利要求1-4任一所述的核酸，所述单链抗体含有SEQIDNO:31或32中第1-240所示的氨基酸序列或者含有SEQIDNO:33或34中第1-240所示的氨基酸序列。8.核酸或核酸变体，其编码具有下组中任一所述的氨基酸序列：序列(1)，与SEQIDNO:31具有至少80％相似性的氨基酸序列；序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宗海，高慧萍，蒋华，石必枝，顾健人，
申请(专利权)人：科济生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31