本发明专利技术属于应用工业微生物领域，公开了一种分泌融合基因usp45‑bgl1及其所编码的蛋白和应用，该融合基因usp45‑bgl1包含乳酸乳球菌分泌蛋白基因usp45的基因片段(81bp)和瑞氏木霉bgl1基因中编码β‑葡聚糖苷酶的核苷酸序列(2139bp)，其核苷酸序列为SEQ ID No.1，全长为2220bp，G+C含量57.21％，编码740个氨基酸。利用该融合基因构建的工程乳酸乳球菌菌株能高效分泌表达β‑葡聚糖苷酶，细胞外分泌β‑葡聚糖苷酶的活性为131mU/ml，能够有效地降解羧甲基纤维素钠。生产的酶制剂安全，能够有效利用纤维素，可用于食品、能源、医药、饲料、纺织、洗涤等工业，具有可观的经济效益。
【技术实现步骤摘要】
一种分泌融合基因usp45-bgl1及其所编码的蛋白和应用
本专利技术属于应用工业微生物领域，涉及一种纤维素水解酶β-葡聚糖苷酶融合基因及其所编码的蛋白和应用。生产的酶制剂安全，能够有效利用纤维素，可用于食品、能源、医药、饲料、纺织、洗涤等工业，具有可观的经济效益。
技术介绍
纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物干重的30％～50％，是地球上分布最广、再生性最佳的结构性碳水化合物，占地球总生物量的40％。对人类而言，纤维素即是自然界中数量最大的可再生性能源，也是自然界碳素循环的中心环节。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有十分重要的意义。纤维素酶是分解纤维素的一类酶。里氏木霉是高效产纤维素酶的真核生物，其产生的纤维素酶具有酶系完全，活性高，能分泌到细胞外，便于分离提纯等优点，被广泛应用于能源、食品、医药、饲料和化工等工业领域。根据催化反应功能的不同，纤维素酶可分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。内切葡聚糖酶可随机水解纤维素非结晶区的β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端，外切葡聚糖酶可从纤维素线状分子的非还原性末端水解切下纤维二糖单位，β-葡聚糖苷酶则将纤维二糖水解成葡萄糖。里氏木霉分泌的β-葡聚糖苷酶是纤维素降解过程中的关键酶，它能够控制纤维素的水解效率，解除纤维二糖对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制。目前，里氏木霉的内切葡聚糖酶基因和外切葡聚糖酶基因分别成功地在乳酸乳球菌中表达，尚无里氏木霉的β-葡聚糖苷酶基因在乳酸乳球菌中成功表达的报道。纤维素降解成水溶性碳水化合物需要内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶协同作用，尚未发现应用内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶基因工程乳酸菌降解纤维素的报道。因此，构建出能分泌β-葡聚糖苷酶的基因工程乳酸菌，以期更好地开发利用纤维素物质资源，实现纤维素物质的价值提升，对人类的可持续发展具有重要的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用乳酸乳球菌分泌蛋白基因usp45部分序列和里氏木霉基因bgl1中编码功能蛋白——β-葡聚糖苷酶的核苷酸序列形成一种融合基因usp45-bgl1，利用该基因构建的工程菌株能高效分泌表达β-葡聚糖苷酶，属于应用工业微生物。生产的酶制剂安全，能够有效利用纤维素，可用于食品、能源、医药、饲料、纺织、洗涤等工业，具有可观的经济效益。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种融合基因usp45-bgl1，它包含乳酸乳球菌分泌蛋白基因usp45基因部分片段(81bp)和里氏木霉bgl1基因中编码功能蛋白——β-葡聚糖苷酶的核苷酸序列(2139bp)，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，全长为2220bp。同上述的融合基因usp45-bgl1核苷酸序列同源性大于50％的核苷酸序列或上述的融合基因usp45-bgl1核苷酸序列的互补序列。上述的融合基因usp45-bgl1在表达β-葡聚糖苷酶中的应用。上述的融合基因usp45-bgl1所编码的融合蛋白，为(1)和(2)中的任意一种：(1)其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，全长为740个氨基酸；(2)与(1)中所述融合蛋白的氨基酸序列同源性大于40％且具有β-葡聚糖苷酶活性的氨基酸序列。含有上述融合基因usp45-bgl1的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。上述的重组表达载体，为将上述的融合基因usp45-bgl1亚克隆至pMG36e原核表达载体中，构建出的重组表达载体pMG36e-usp45-bgl1。含有上述的重组表达载体pMG36e-usp45-bgl1的转基因重组乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1。上述的转基因重组乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1的构建流程为：提取里氏木霉RNA，根据GenBank里氏木霉的bgl1基因(基因收录号：AB003694，长度为2657bp)，采用其cDNA序列为模板，上游引物5'-GTTGTACCTCCTGCAGGGACTC-3'和下游引物5'-CTACCGACAGAGTGCTCGTCAG-3'，PCR合成bgl1基因正确编码功能蛋白——β-葡聚糖苷酶的序列(2139bp)；根据GenBank乳酸乳球菌usp45基因编码(基因收录号：M60178)部分序列(81bp)和bgl1基因正确编码功能蛋白——β-葡聚糖苷酶的序列，采用重叠延伸PCR合成技术合成正向带有SmaI酶切位点、反向带有SphI酶切位点的usp45-bgl1融合基因，将经SmaI和SphI双酶切后的usp45-bgl1融合基因和同样用这两种酶切好的克隆载体pGHn质粒在DNA连接酶作用下进行连接，获得质粒pGHn-usp45-bgl1；将质粒pGHn-usp45-bgl1克隆到大肠杆菌EscherichiacoliTop10并获取阳性克隆，提取阳性克隆的质粒并酶切回收正确的usp45-bgl1融合基因，亚克隆至pMG36e原核表达载体中，构建出重组表达载体pMG36e-usp45-bgl1，采用电转化法转化至乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363中，构建转基因重组乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1。上述PCR合成bgl1基因正确编码功能蛋白——β-葡聚糖苷酶序列的过程中其PCR程序为：94℃5分钟；30个循环：98℃15秒，55℃15秒，72℃4分钟；72度10分钟。上述的融合基因usp45-bgl1及上述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在制备β-葡聚糖苷酶及水解纤维素中的应用。上述的转基因重组乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1在分泌表达β-葡聚糖苷酶蛋白质中的应用。本专利技术的技术方案中，采用重叠延伸PCR合成技术合成正向带有SmaI酶切位点，反向带有SphI酶切位点的usp45-bgl1融合基因；将经SmaI和SphI双酶切后的usp45-bgl1融合基因和同样用这两种酶切好的克隆载体pGHn质粒在DNA连接酶作用下进行连接，获得质粒pGHn-usp45-bgl1；将质粒pGHn-usp45-bgl1克隆到大肠杆菌Top10并获取阳性克隆。提取阳性克隆的质粒并采用SmaI和SphI双酶切回收正确的usp45-bgl1融合基因，该正确的usp45-bgl1融合基因核苷酸序列为SEQIDNo.1，全长(从起始密码子到终止密码子)为2220bp，G+C含量为57.21％，编码的740个氨基酸，其编码的氨基酸序列为：SEQIDNo.2。然后将正确的usp45-bgl1融合基因亚克隆至pMG36e原核表达载体中，构建出重组表达载体pMG36e-usp45-bgl1，采用采用电转化法(2150～2350V)转化至L.lactissubsp.lactisMG1363构建重组乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1；转接到M17琼脂培养基(含有质量体积比5g/L羧甲基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合基因usp45‑bgl1，它包含了乳酸乳球菌分泌蛋白基因usp45基因部分片段(81bp)和里氏木霉bgl1基因中编码功能蛋白——β‑葡聚糖苷酶的核苷酸序列(2139bp)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，全长为2220bp。
【技术特征摘要】
1.一种融合基因usp45-bgl1，它包含了乳酸乳球菌分泌蛋白基因usp45基因部分片段(81bp)和里氏木霉bgl1基因中编码功能蛋白——β-葡聚糖苷酶的核苷酸序列(2139bp)，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，全长为2220bp。2.同权利要求1所述的融合基因usp45-bgl1核苷酸序列同源性大于50％的核苷酸序列或权利要求1所述的融合基因usp45-bgl1核苷酸序列的互补序列。3.权利要求1或2所述的融合基因usp45-bgl1在表达β-葡聚糖苷酶中的应用。4.权利要求1或2所述的融合基因usp45-bgl1所编码的融合蛋白，其特征在于为(1)和(2)中的任意一种：(1)其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，全长为740个氨基酸；(2)与(1)中所述融合蛋白的氨基酸序列同源性大于40％且具有β-葡聚糖苷酶活性的氨基酸序列。5.含有权利要求1～2中任意一项所述融合基因usp45-bgl1的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：为将权利要求1或2所述的融合基因usp45-bgl1亚克隆至pMG36e原核表达载体中，构建出的重组表达载体pMG36e-usp45-bgl1。7.含有权利要求6所述的重组表达载体pMG36e-usp45-bgl1的转基因重组乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1。8.根据权利要求7所述的转基因重组乳酸乳球菌L.lactissubsp.lactisMG1363/pMG36e-usp45-bgl1，其特征在于：该转基因重组乳酸乳球菌的构建流程为：提取里氏木霉RNA，根据GenBank里氏木霉的bgl1基因(基因收录号：AB...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘秦华，邵涛，董志浩，王思然，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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