玉米制造技术

本发明专利技术提供玉米Lc基因在麻竹转基因育种中的应用，具体为利用玉米Lc基因提高麻竹花青素含量，利用Lc基因提高麻竹花青素含量的方法包括如下步骤：通过基因克隆的方法获得玉米中花青素合成的调控基因Lc的cDNA序列；并构建用于麻竹转化的表达载体；将构建好的表达载体转入到根癌农杆菌中，转化麻竹，并获得转基因植株。为利用转基因麻竹开展园艺性状的研究或是生产花青素提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
玉米LC基因在麻竹转基因育种中的应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及玉米LC基因在麻竹转基因育种中的应用。
技术介绍
麻竹是禾本科竹亚科牡竹属麻竹亚属，在福建中国台湾广东广西贵州云南等部自然分布，是中国华南及东南沿海地区重要的笋材两用的大型丛生竹种之一，具有极高的经济价值和社会价值。花青素属于黄酮类化合物，广泛存在于植物界中，是控制植物颜色的最主要色素化合物之一。被子植物中约有80%的植物颜色是由花青素的种类和含量所决定的。花青素的合成途径目前较为清楚，它的合成首先起始于类黄酮代谢途径，经过近20个步骤，形成了不同分支途径，并在花青素苷基本骨架的不同位置形成了取代基的差异，进而形成了多种多样的花青素。花青素合成的基因主要有两大类，一类是结构基因，主要包括一些在合成途径中编码催化花青素生化反应的多种酶类；二类是调控基因，主要包括MYB，MYC及WD40家族的转录因子。这些转录因子通过直接调控结构基因的时空表达，来调控花青素合成的含量和种类，进而影响花色。玉米的Lc基因属于bHLHMYC家族的调节基因，编码约610个氨基酸。在玉米中，单个的Lc基因过量表达可以激活花青素合成的整条途径，进而提高花青素类化合物的含量。该基因在玉米、水稻、稗草等多个物种中有相关的应用报道，但在林木遗传育种，尤其是竹类遗传育种方面没有相关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供玉米LC基因在麻竹转基因育种中的应用，为利用转基因麻竹开展园艺性状的研究或是生产花青素提供了基础。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术涉及利用Lc基因提高麻竹花青素含量的方法，通过基因克隆的方法获得玉米中花青素合成的调控基因Lc的cDNA序列；并构建用于麻竹转化的表达载体；将构建好的表达载体转入到根癌农杆菌中，转化麻竹，并获得转基因植株；对转基因植株进行分子鉴定和表型分析确定花青素的含量。基因克隆的方法中采用的引物为Forward:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCGCTTTCAGCTTCCCG-3’；Reverse:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCACCGCTTCCCTATAGCTT-3’。本专利技术表明来自玉米的Lc基因可以用来作为分子标记基因用于辅助麻竹的转基因育种，也可以通过过量表达该基因获得花青素含量更高的麻竹材料。本专利技术的优点在于：目前可调控花青素的基因有很多，但不清楚哪一种基因适合于竹类，来自玉米中的Lc基因是一个备选。通过检索发现，并无通过利用Lc基因提高竹类花青素含量的报道。本专利技术提供一种提高麻竹花青素含量的方法，明确了玉米的Lc基因适用于麻竹，通过转基因的手段获得异源表达玉米Lc基因的转基因麻竹植株、组织或是细胞；提供利用玉米Lc基因提高麻竹花青素含量的方法；通过利用玉米Lc基因改变麻竹的颜色，提供一种改变麻竹园艺性状的方法。本专利技术利用从玉米种克隆出的控制花青素含量的基因Lc，构建在ubiquitin启动子的驱动Lc基因的表达载体。利用农杆菌介导的方法，将Lc基因导入到麻竹基因组并再生出植株。PCR的方法检测发现Lc基因已经导入到麻竹基因组中，qRT-PCR方法确认了该基因的表达情况，表型观察发现，转基因植株呈现出一种花青素过量积累的表型。通过花青素的测定，确定转基因植株的花青素含量显著提高。本专利技术提供了一种利用Lc基因提高麻竹中花青素含量的方法，为利用转基因麻竹开展园艺性状的研究或是生产花青素提供了基础。附图说明图1植物表达载体的基本原件。LB，左边界；T35s，35S终止子；HPTII，编码潮霉素抗性基因；p35S-pro,35S遍在表达型启动子；Tnos,NOS终止子，Lc，玉米的leafcolor基因；pUBI，ubiquitin启动子；RB，右边界。图2再生过程中过量表达Lc基因的转基因愈伤组织（左图），再生小苗（中间和右图）均呈颜色改变的表型，上为对照组；下转基因组。图3土中生长的麻竹呈现红色；i野生型整株苗；ii过量表达花青素的转基因植株；iii、v和vii为对照组的茎、叶梢及叶片；iv、vi和viii为转基因组的茎、叶梢及叶片。图4PCR鉴定转基因植株；1-8，8个不同的转基因株系，通过不同批次的转化得到8个独立的转基因株系；WT、H2O负对照，+正对照。图5qPCR的方法鉴定转基因植株中，LC基因的表达量。图6转Lc基因的麻竹中中花青素的含量大大提高。具体实施方式实施例11)载体的构建：本专利技术所用的表达载体是经改造过的Pcamiba1301载体，该载体可通过gatewaycloning的方法将目的基因LC导入到该载体，由Ubiquitin启动子（UBI）驱动目的基因的表达。通过在genebank上检索发现，该目的基因LC的基因编号为M26227。根据获得的目的基因LC核苷酸序列，通过引物Forward:’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCGCTTTCAGCTTCCCG-3’andReverse:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCACCGCTTCCCTATAGCTT-3’，以P35S-Lc载体（H.Wang,J.Yang,M.Zhang,W.Fan,N.Firon,S.Pattanaik,L.Yuan,P.Zhang,AlteredPhenylpropanoidMetabolismintheMaizeLc-ExpressedSweetPotato(Ipomoeabatatas)AffectsStorageRootDevelopment,Scientificreports,6(2016)18645.）为模板进行PCR扩增，将获得的PCR产物通过基因克隆的方法连入PDONR207中间载体，经测序后通过LR反应进入PCAMBIA1301载体。在构建好的载体中，LC基因由UBI启动子驱动；LR反应使用Invitrogen公司的MultiSiteGateway®Pro试剂盒完成,操作过程参照使用说明书。（图1）将构建好的植物表达载体按照以下步骤导入到农杆菌GV3101中。a.根癌农杆菌GV3101在固体LB培养基（含有Rif100g/mL和Gen100g/mL）平板上划线，28℃培养约2-3天后长出单菌落；b.挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，28℃，220rpm培养过夜；c.按1:50v/v比例接种于50mLLB液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.4~0.5；d.4℃、5000rpm离心5分钟，弃上清；e.菌体用10mL预冷的0.15mol/LNaCl重悬；f.4℃、5000rpm离心5分钟，弃上清；g.菌体用1mL预冷的20mmol/LCaCl2重悬，分装为200L/管；h.在200uL感受态细胞中加入1µg(5uL)质粒，冰浴30分钟；i.液氮中冷冻1分钟，37℃水浴融化细胞2-3分钟；j.加入1mLLB培养基，28℃轻轻振荡2-4小时；k.轻轻离心1分钟，用0.1mLLB悬浮菌体，将细胞悬液涂布于LB平板上（含Rif100mg/L、Kn50mg/L或Gen100mg/L），28℃培养2-3天；l.单克隆接种于LB液体本文档来自技高网...

【技术保护点】
玉米

【技术特征摘要】
1.玉米LC基因在麻竹转基因育种中的应用。2.玉米LC基因在提高麻竹花青素含量中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：利用Lc基因提高麻竹花青素含量的方法包括如下步骤：通过基因克隆的方法获得玉米中花青素合成的调控基因Lc的cDNA序列；并构建用于麻竹转化的表达载体；将构建好的表达载体转入到根癌农杆菌中，转化麻竹，并获得转基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱强，叶善汶，蔡昌杨，唐晓珊，朱彩萍，尹腾飞，张丽，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35