本发明专利技术属于植物基因工程技术领域。具体涉及调控番茄果实苹果酸积累的关键基因SlALMT9的克隆及应用。本发明专利技术克隆的SlALMT9基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示，该基因包含功能突变位点的启动子序列如SEQ ID NO：3所示。SlALMT9基因在调控番茄果实苹果酸积累方面具有显著的功能，同时该基因可以介导根系分泌苹果酸抵抗酸性土壤中铝毒对植物根系的影响。因此，该基因可以在番茄品质改良以及耐铝等方面进行应用。
【技术实现步骤摘要】
调控番茄果实苹果酸积累的关键基因SlALMT9的克隆及应用
本专利技术属于植物基因工程
具体涉及一个调控番茄果实苹果酸积累的关键基因SlALMT9的克隆，功能鉴定及应用。通过全基因组关联分析(GWAS)结合集团分离分析法(BSA)定位到的SlALMT9在调控番茄果实苹果酸积累方面具有显著的功能，同时该基因可以介导根系分泌苹果酸抵抗酸性土壤中铝毒对植物根系的影响。因此，该基因可以在番茄品质改良，特别是在耐铝等方面进行应用。技术背景不管是鲜食番茄还是加工番茄，果实的风味对消费者尤其重要。番茄果实风味品质主要由果实中糖酸含量及糖酸比决定，其中苹果酸作为番茄果实中含量最高的两种有机酸之一，直接影响果实的风味。与柠檬酸相比，苹果酸具有酸味柔和爽口，热量低等特点，更符合高品位饮食文化的要求(吴军林等，2014)。同时，苹果酸作为重要的代谢中产物，是三羧酸循环(TCA循环)及其支路乙醛酸循环代谢过程中的重要中间产物，也是CO2固定反应的中间产物，参与生物体能量代谢。另外，植物可以通过根系分泌苹果酸来增加对酸性土壤中铝毒的抗性(Hoekengaetal.2006)。苹果酸也是苹果酸天冬氨酸穿梭的重要组成部分，参与维持渗透压和电荷平衡，进而调控植物气孔的开关。对人和动物来说，苹果酸能够有效的提高运动能力，具有抗疲劳、保护心脏、促进羧酸盐的代谢、促进线粒体呼吸、改善记忆能力、增强钙的活性、降低抗癌药物毒副作用等生理功能。因此，改良番茄果实中苹果酸含量是国内外主要的育种目标之一。苹果酸有3种形式存在，即D-苹果酸、DL-苹果酸和L-苹果酸，只有具有左旋结构的L-苹果酸才具有生物活性。绝大部分动植物中存在的都是有生物活性的L-苹果酸。果实细胞中苹果酸的积累受到细胞中各个亚细胞器的交互调控，同时外界环境如水分、矿质营养、温度也影响果实中苹果酸的积累。前人研究表明，果实中苹果酸含量产生差异的主要原因是由于自身代谢差异所导致的，主要包括苹果酸的合成和降解(Sweetmanetal.2009)。首先，糖酵解产生的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)在磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPC)的作用下可逆的形成草酰乙酸，随后草酰乙酸在苹果酸脱氢酶(NAD-cytMDH)用下形成苹果酸，这一过程是在细胞质中完成的。在葡萄果实发育过程中，对PEPC在转录水平和酶活水平分析，结果表明PEPC对苹果酸含量有显著影响。在苹果中超量表达MdcyMDH基因导致了苹果酸、果糖和蔗糖含量的增加，同时也导致了苹果酸相关基因的上调表达，说明NAD-cytMDH直接参与了苹果酸的合成。在果实成熟后期，果实会出现从有机酸的积累到糖分积累的转变，这个转变过程是通过糖异生途径实现的。有机酸降解过程中比较关键的酶包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和苹果酸酶(NADP-cytME)。研究表明低苹果酸含量的栽培苹果中主要是由于PEPCK活性的降低导致的。同时在一些物种中也发现了NADP-cytME在果实发育后期参与了苹果酸的降解。虽然苹果酸合成和降解的途径及其相关基因的研究比较清楚，然而像苹果酸这类代谢物的积累仅仅用结构基因的功能是无法完全解释的。果实中大部分的糖酸是积累在液泡中的，因此液泡中苹果酸的储存对果实中苹果酸积累尤为重要。在细胞质中合成的苹果酸以二阶阴离子的形式存在，并被转运到液泡中，其转运的效率受到液泡中pH和液泡膜两边的电势梯度的影响。苹果酸向液泡的转运是通过液泡膜上的转运蛋白来实现的。在模式植物拟南芥中，液泡膜转运蛋白(AttDT)介导胞质中的苹果酸向液泡运输从而影响叶片中苹果酸的含量。近期，也有研究表明另一类苹果酸转运蛋白(ALMT)能介导植物中苹果酸的转运。ALMT蛋白家族是植物特有的一类蛋白，其N末端通常包含5～7个跨膜区，C端则形成亲水性的尾部(Delhaizeetal.2007)。在酸性土壤环境中(pH<5.5)，铝离子(Al3+)会从硅酸盐或氧化物中释放出来，溶解到土壤溶液中，从而诱导ALMT基因的表达，进而激活苹果酸向外的运输来抵抗铝毒。在小麦、拟南芥、甘蓝等作物中已经相继克隆类似的ALMT基因。但是类似的苹果酸转运蛋白在番茄等重要的园艺作物中还鲜有报道。番茄作为重要的园艺作物，是研究浆果类果实发育的模式作物，其栽培种S.lycopersicumLA1706及两个野生种S.pimpinellifoliumLA1589和S.pennelliiLA0716的全基因组测序结果已经发表(TomatoGenomeConsotium2012；Bolgeretal.2014)。大量的基因组、转录组、代谢组信息可以利用(http://solgenomics.net/,http://ted.bti.cornell.edu/)。但是利用关联分析挖掘功能基因在番茄中的应用才刚刚起步。本项目利用360份重测序的核心种质进行全基因组的关联分析定位到一个调控苹果酸含量的QTL，并通过连锁作图对这个位点进行了验证进一步确定了候选基因SlALMT9。进一步利用生物信息学及分子生物学等技术手段对该基因的功能及突变位点的作用机制进行解析。该专利技术中克隆的基因将为我国番茄品质遗传改良以及植物耐铝育种奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一个调控番茄果实苹果酸积累的关键基因SlALMT9的克隆及应用。本专利技术通过GWAS结合BSA技术克隆获得的一个调控番茄果实苹果酸积累的关键基因(SlALMT9)，该基因启动子中一个关键的插入/缺失(片段命名为indel_3)片段是导致自然群体中苹果酸含量差异的主要原因。利用转基因技术，对SlALMT9基因在番茄果实苹果酸调控方面的功能进行验证。针对功能突变位点indel_3，本专利技术开发了一个分子标记用于番茄品质育种(苹果酸)的辅助选择。本专利技术是这样实现的：本专利技术通过利用272份全球范围收集的番茄核心种质及高苹果酸材料TS-40与低苹果酸材料TS-66构建一个F2分离群体(具体实施步骤见实施例1)，采用GWAS结合BSA技术，从番茄中克隆获得了SlALMT9基因。SlALMT9属于铝激活的苹果酸转运蛋白家族，与苹果中报道的苹果酸调控基因Ma属于同一个家族，该基因的cDNA序列如序列表SEQIDNO：1所示，它包括1680个碱基对；其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，它编码559个氨基酸；该基因启动子序列如SEQIDNO：3所示，它包含3个碱基的插入/缺失。本专利技术利用克隆的SlALMT9基因的不同基因型转化番茄，根据果实中苹果酸含量的变化确定了功能突变位点indel_3。针对该功能突变位点，设计了一个CAPS标记用于检测番茄材料中SlALMT9的基因型，进而用于番茄的品质选育的辅助选择。更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。附图说明序列表SEQIDNO：1是SlALMT9基因的cDNA序列。序列长度为1680bp，该基因的对应的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：1中1-1680位序列所示。序列表SEQIDNO：2是SlALMT9基因编码的蛋白质序列。编码559个氨基酸残基。序列表SEQIDNO：3是indel_3-basedCAPS标记的核苷酸序列，序列长度为748bp。图1：是番茄自然群体和杂交群体果实中苹本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个调控番茄苹果酸积累的SlALMT9基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一个调控番茄苹果酸积累的SlALMT9基因，它的cDNA序列如序列表SEQIDNO：1所示。2.一个调控番茄苹果酸积累的SlALMT9基因，该基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO：2所示。3.一种适用于番茄辅助选择的...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶志彪，叶杰，李汉霞，张余洋，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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