一种烟草抗旱基因NtSAP5及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种烟草抗旱基因NtSAP5及其克隆方法与应用；烟草抗旱基因NtSAP5核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；过量表达该基因能提高烟草对干旱胁迫的适应性，NtSAP5在烟草抗旱领域具有广阔的应用前景。本发明专利技术中，干旱处理的烟草幼苗叶片中，所述的泛素E3连接酶编码基因NtSAP5被诱导表达。本发明专利技术所述的蛋白NtSAP5是植物泛素化蛋白降解途径中的关键酶类，所以调控NtSAP5的表达能够调节植物对干旱的抗性。因此所述的烟草抗干旱基因NtSAP5在植物抗旱领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

【技术实现步骤摘要】
一种烟草抗旱基因NtSAP5及其克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种烟草抗旱基因NtSAP5及其克隆方法与应用。
技术介绍
干旱严重影响作物的生长发育、产量及品质。提高植物的抗旱能力已经成为现代植物研究工作中的关键问题之一。抗旱机理的研究是抗旱育种的基础，也是育种的关键因素之一。经历了几十年的努力，对植物抗旱的研究已从抗旱指标的表观因素分析，进入到分子及基因水平的探索。近年来，随着全球气候变暖，干旱已成为我国作物生产中频繁发生的自然灾害。烟草作为中国重要的经济作物，在整个生育期对水分的要求很高。中国大部分烟区处于干旱、半干旱环境中，而且优质烟区多位于丘陵山区，常因土壤干旱而影响烟株的生长发育，导致烟叶的产量和品质降低，干旱已成为制约我国烟叶产量与品质提高的主要限制因子之一。因此，加强烟草抗旱基因资源的挖掘和利用，对于烟草抗旱新品种培育，实现烟草农业可持续发展具有重大意义。自20世纪80年代以来，国内外学者在干旱对烟草生长、发育、代谢的影响等方面做了大量研究，取得了一些重要进展。归纳起来主要有以下几个方面:第一，干旱对烟草生理的影响，主要表现在:(1)干旱胁迫影响了叶绿素的合成，促进了叶绿素的分解，从而影响了叶片的光合效率(PlantMolecularBiology，1979，20:37-44)；(2)干旱胁迫导致植株氮素代谢关键酶-硝酸还原酶(NR)的活性降低，而蛋白水解酶活性增强引起脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和缬氨酸等大量积累；(3)干旱胁迫导致叶片膜脂过氧化作用增强，膜透性增加，丙二醛(MDA)含量升高，出现电解质外渗。抗氧化保护酶S0D、P0D、CAT等酶活性显著下降。第二，干旱对烟草生长发育的影响，主要表现在:(I)干旱胁迫降低了种子的萌发和幼苗的成活；(2)抑制了根系的生长，从而影响了矿质营养的吸收；(3)干旱胁迫导致植株矮小，节间短，叶片小，易早衰。这些研究较好地阐明了干旱对烟草生长、发育及代谢影响的生理生化基础，但缺乏对烟草抗旱分子遗传机理的研究。近年来，随着分子生物学和基因组学研究的深入，抗旱基因的发掘成为目前作物抗逆遗传资源与品种改良研究的热点，越来越多的抗旱相关基因相继被克隆和鉴定。按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类:第一类基因为功能基因，主要在植物抗性中起保护作用。这一类基因主要包括渗透调苄基因如:海藻糖合成酶基因TPSlJf氨酸合成酶基因P5CS、甘露醇合成基因mtlD、甜菜碱合成酶级以内BADH、及多按合成基因Odc等；保护生物大分子的活性基因如:脱水蛋白基因BDN1、水通道蛋白基因AQP和晚期胚胎发生丰富蛋白LEA等。第二类基因为调苄基因，主要在信号传导和逆境基因表达过程中起调节作用，主要包括一些转录因子基因如:DREB、MYB、bZIP、WRKY、NAC等。这些基因已在植物基因工程中得到应用。泛素化生物体表观遗传修饰的一种重要形式，该过程能够使生物体内蛋白发生泛素化，泛素化的蛋白能够被降解。泛素连接酶E3是泛素化过程中的关键酶类，决定了那些蛋白能够被泛素化。泛素化在植物激素调控、花发育和病原菌防卫反应中起着重要的作用(PlantJ,2010,61:1029-1040；JExpBot，2007，58:221-227)。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种烟草抗旱基因NtSAP5；第二目的在于提供所述的烟草抗旱基因NtSAP5的克隆方法，第三目的在于提供所述的烟草抗旱基因NtSAP5的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的烟草抗旱基因NtSAP5的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；B、NtSAP5基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtSAP5基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。本专利技术的第三目的是这样实现的，所述的烟草抗旱基因NtSAP5在获得抗干旱转基因烟草植株中的应用。本专利技术提供了一种新的植物抗旱相关蛋白及其编码基因。本专利技术所提供的植物抗旱相关蛋白，名称为NtSAP5，其来源于云烟87栽培烟草，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQIDNO：2；2)将序列表中SEQIDNo：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱相关的蛋白质。序列表中的序列2由154个氨基酸组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。NtSAP5的编码基因(NtSAP5)也属于本专利技术的保护范围。NtSAP5的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQIDNo：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQIDNo：2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。含有本专利技术NtSAP5的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本专利技术的保护范围。扩增NtSAP5中任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了利用该基因增强植物抗旱性的方法，是在植物中过量表达上述植物抗旱性相关蛋白编码基因。过量表达上述植物抗旱性相关蛋白编码基因NtSAP5可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因过表达的方法，农杆菌介导转化过表达载体，对基因编码匡进行优化修改，对该基因启动子进行优化以达到过表达效果等方法实现。本专利技术过量表达基因的方法并不限于上述几种方法，只要能过量表达NtSAP5即可。利用任何基因过表达或者基因修饰方法该NtSAP5使植物表现为抗旱；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本专利技术所提供的NtSAP5转入植物中，植物就表现出干旱不敏感。本专利技术的NtSAP5基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物苗期叶片失水程度来筛选转化植株。携带有本专利技术NtSAP5基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。本专利技术的植物抗旱相关蛋白及其编码基因为农作物尤其是烟草抗旱育种提供基因与技术的支持。本专利技术中，干旱处理的烟草幼苗叶片中，所述的泛素E3连接酶编码基因NtSAP5被诱导表达。本专利技术所述的蛋白NtSAP5是植物泛素化蛋白降解途径中的关键酶类，所以调控NtSAP5的表达能够调节植物对干旱的抗性。因此所述的干旱响应的基因NtSAP5在植物抗旱领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。附图说明图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草抗旱基因NtSAP5，其特征在于所述的烟草抗旱基因NtSAP5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种烟草抗旱基因NtSAP5，其特征在于所述的烟草抗旱基因NtSAP5的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的烟草抗旱基因NtSAP5，其特征在于所述的烟草抗旱基因NtSAP5编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种权利要求1或2所述的烟草抗旱基因NtSAP5的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；B、NtSAP5基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtSAP5基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。4.根据权利要求3所述的烟草抗旱基因NtSAP5的克隆方法，其特征在于B步骤中所述的引物为：正向引物：5’-ATGGCTCAGAGAACAGAGAAAG-3’反向引物：5’-TCAAAGTTTAACGATCTTCG-3’。5.根据权利要求3所述的烟草抗旱基因NtSAP5的克隆方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢贺，杨大海，白戈，姚恒，肖炳光，张宜寒，李永平，童文杰，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53