本发明专利技术公开了一种玉米转录因子VP1在调控作物株高及籽粒淀粉含量中的应用，其是将玉米转录因子VP1基因插入到带有植物选择基因的植物表达载体中，目标基因由玉米组成型Ubiquitin启动子启动，选择标记基因hptII由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子启动；通过农杆菌介导的玉米胚愈伤组织的遗传转化，批量获得了转基因植株。本发明专利技术对转基因后代纯合株系株高及籽粒性状进行鉴定表明，与野生型植株相比，过表达VP1基因植株株高降低约35％，种子淀粉含量提高约3％。该方法为改善玉米、高粱、水稻、小麦等禾本科作物株高、提高禾本科作物籽粒淀粉含量开辟了一条新途径。
【技术实现步骤摘要】
转录因子VP1在调控作物株高及籽粒淀粉含量中的应用
本专利技术属于农作物的基因工程育种领域，具体地说，涉及一种转录因子VP1在调控作物株高及籽粒淀粉含量中的应用。
技术介绍
淀粉是人类食品和家畜饲料的主要碳水化合物组分，在工业及其他领域也有广泛应用，在国民经济中占有非常重要的地位，随着能源短缺和人口增长，对淀粉的需求日益增加，用遗传改良方法获得高淀粉含量玉米是满足这一条需求的途径。玉米是制造淀粉的重要原料之一，由于玉米具有产量高、适应性强、易于种植等特点，所以作为淀粉加工原料，具有如下特点：玉米淀粉的质量好；在相同的加工设备条件下，出粉率高2％～4％；玉米综合利用的潜力大，加工玉米淀粉后的废料可提取玉米油、玉米蛋白粉、胚芽饼和粗饲料，几乎玉米产品的99％都可得到利用。玉米淀粉约占世界淀粉总产量的81.8％。全世界淀粉产量为1100万吨，而玉米淀粉高达900万吨左右。淀粉合成的主要场所是淀粉体和叶绿体，整个过程受到一系列酶活性的调控。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是在淀粉合成途径中起调控作用的主要的酶，是影响淀粉合成速率的关键因子。在淀粉合成过程中，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)起着关键作用，它催化了淀粉合成反应中的第一步反应，生成有活性的葡糖基供体ADP-葡萄糖。在谷物的胚乳中的AGPase有85％-95％都是胞质型的，是由两个大亚基和两个小亚基组成的异源四聚体，大小亚基是由不同基因编码的。玉米胚乳中编码该酶大小亚基的基因分别是Sh2、Bt2。有研究表明，玉米的点突变的AGPase基因转入其他作物后，增强了亚基之间的相互作用，并且降低了磷的抑制效应，AGPase活力更强，最终增加了种子重量及总的生物量。但是也有证据证明在谷物的胚乳中，这种调节并没有在其它器官如叶子中重要。高淀粉玉米是指籽粒淀粉含量达70％以上的专用型玉米，而普通玉米淀粉含量只60％～69％。玉米淀粉是各种作物中化学成分最佳的淀粉之一，有纯度高(达99.5％)、提取率高(达93％～96％)的特点，广泛应用于食品、医药、造纸、化学、纺织等工业，据调查，以玉米淀粉为原料生产的工业制品达500余种。因此，发展高淀粉玉米生产，不但可为淀粉工业提供含量高、质量佳、纯度好的淀粉，同时可获得较高的经济效益。高淀粉玉米不仅提高了籽粒中的淀粉含量，其籽粒的物理性状和营养成分也发生了变化。高淀粉玉米的籽粒粒重、胚乳重比普通玉米和高油玉米高，而胚重则较低，胚乳较大，胚/胚乳比值最小。目前生产上推广的高淀粉玉米品种籽粒淀粉含量达73％左右，显著高于普通玉米和高油玉米；淀粉成分中支链淀粉和直链淀粉含量都比普通玉米高，但支链/直链的值相差较小，即混合型高淀粉玉米同时提高了支链淀粉和直链淀粉的含量。种植高淀粉玉米的经济效益是非常显著的，高淀粉玉米籽粒的淀粉含量在73％以上，出粉率比普通玉米增加2％以上。据庄铁成估算，若种植70万公顷高淀粉玉米，则比相同数量的普通玉米多生产35万吨淀粉，每吨淀粉以1700元计算，可增加效益5.95亿元。株高是玉米产量性状中一个非常重要的性状，培育株高适度降低的玉米品种，有利于通过增加种植密度提高玉米产量，防止植株倒伏。植物VP1/ABI3家族转录因子最先在玉米中发现。VP1位点突变导致玉米种子胚和糊粉层的成熟过程受阻碍。突变的种子中胚的发育不受抑制，从而导致穗萌现象；另外，在突变种子的糊粉层中花青素的合成也受到抑制。同时，VP1突变降低了胚对ABA的敏感性。VP1在拟南芥中的同源基因为ABI3，其突变体具有与玉米相似的表型。在玉米中VP1转录因子只在糊粉层和胚中表达，在玉米受到胁迫时也在其它组织中表达。在玉米糊粉层中VP1通过与RYrepeat元件相互作用转录激活C1基因的表达，进而激活花青素合成路径。VP1往往与ABA共同作用调控基因的表达，在拟南芥abi3突变体中异源组成过表达VP1激活大量种子特异的基因在其它组织中表达，而其中受ABA和VP1共激活的基因的启动子中富含RYrepeat元件。目前，淀粉合成的路径及相关的酶均已被鉴定，人们试图通过基因工程的方法修饰淀粉合成相关酶，从而提高淀粉含量。其中，AGPase作为淀粉合成路径中的限速酶，一直是科学家们研究的热点。Stark等(StarkDM,TimmermanKP,BarryGF,PreissJ,KishoreGM.1992.RegulationoftheamountofstarchinplanttissuesbyADPglucosepyrophosphorylase.Science258,287-292.)将大肠杆菌ADPG合成酶基因glgC导入土豆中，使得土豆中的淀粉含量增加了35％以上。然而转基因植株的淀粉含量与GlgC蛋白量并不存在共相关，在其它glgC基因过表达土豆品种中虽然AGPase活性提高了4倍，但淀粉含量却没有增加。将glgC基因导入玉米中发现玉米籽粒粒重增加了13-25％，但并没有观察到淀粉含量发生变化。在玉米中通过修饰胚乳中AGPase大亚基基因Sh2，使其对Pi的抑制不敏感，发现粒重显著增加，但淀粉含量却没有显著变化。这些研究表明增加单个淀粉合成相关基因的表达并不能显著地提高淀粉含量。Yang等(YangJ,ZhangJ,WangZ,XuG,ZhuQ.2004.Activitiesofkeyenzymesinsucrose-to-starchconversioninwheatgrainssubjectedtowaterdeficitduringgrainfilling.PlantPhysiol135,1621-1629.)对未成熟的小麦籽粒外施ABA发现能同时增加多种淀粉合成相关酶的活性，进而显著地提高淀粉的含量；Jiang等(JiangL,YuX,QiX,YuQ,DengS,BaiB,LiN,ZhangA,ZhuC,LiuB,PangJ.2013.Multigeneengineeringofstarchbiosynthesisinmaizeendospermincreasesthetotalstarchcontentandtheproportionofamylose.TransgenicRes22,1133-1142.)通过同时将多个淀粉合成相关基因转化玉米发现籽粒总淀粉含量和直链淀粉比例显著提高。这些研究表明要想提高籽粒的淀粉含量，同时提高多个淀粉合成关键基因的表达才是合理的途径。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种转录因子VP1在调控作物株高及籽粒淀粉含量中的应用，该转录因子VP1突变体能够使其在玉米中过表达降低株高及提高籽粒的淀粉含量。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种转录因子VP1基因在调控作物株高及籽粒淀粉含量中的应用，所述转录因子VP1基因的序列如SEQIDNO.1所示，编码蛋白序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，所述禾本科作物为高粱、水稻或小麦中的一种。进一步地，将转录因子VP1基因插入到带有植物选择标记基因的植物表达载体中，目标基因由玉米组成型启动子Ubiquitin启动，选择标记基因hptII由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子启动；通过农杆菌介导的玉米胚愈伤组织的遗传转化，批量获得了转基因植株。本文档来自技高网...
【技术保护点】
玉米转录因子VP1基因在调控禾本科作物株高及籽粒淀粉含量中的应用，其特征在于，所述玉米转录因子VP1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.玉米转录因子VP1基因在调控禾本科作物株高及籽粒淀粉含量中的应用，其特征在于，所述玉米转录因子VP1基因的序列如SEQIDNO.1所示，蛋白质序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述禾本科作物为高粱、水稻或小麦中的一种。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将转录因子VP1基因插入到带有植物选择标记基因的植物表达载体中，目标基因由玉米组成型启动子Ubiquitin启动，选择标记基因hptII由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子启动；通过农杆菌介导的玉米胚愈伤组织的遗传转化，批量获得了转基因植株。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)根据转录因子VP1基因设计PCR扩增引物对，其为5’端引物和3’端引物，其中，5’端引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，3’端引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；2)以玉米未成熟种子的mRNA为模板，合成玉米籽粒cDNA文库采用PCR方法，获得玉米转录因子VP1基因；3)构建含有VP1基因的植物表达载体p3301-VP1；4)将植物表达载体p3301-VP1转化农杆菌；5)通过农杆菌介导的玉米胚愈伤组织的遗传转化，批量获得了转基因植株。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述构建含有VP1基因的植物表达载体pCAMBIA3301-VP1具体如下：提取玉米基因组DNA，设计含HindIII和BamHI酶切位点的特异引物扩增Ubiquitin基因启动子序列；提取玉米授粉后15天种子总RNA，反转录成cDNA，设计含BamHI和SacI酶切位点的特异引物扩增VP1基因编码区序列；然后将酶切后的两片段连接入含Nos终止子的中间载体pBI221，最后利用HindIII和EcoRI酶切，获得含Ubiquitin启动子、VP1基因和Nos终止子的酶切片段；将此酶切片段连接入pCAMBIA3301的HindIII和EcoRI位点并测序验证，获得植物表达载体pCAMBIA3301-VP1。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含HindIII和BamHI酶切位点的特异引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQID...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄玉碧，李炀平，胡育峰，张军杰，刘汉梅，刘应红，余国武，龙田丹，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51
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