本发明专利技术提供与番茄果实颜色性状相关的分子标记及应用，所述分子标记包含2个SNP标记和2个InDel标记。SNP-p位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游第8616bp处，此处碱基为C的为红果番茄，此处碱基为A的为粉果番茄。SNP-s位于SlMYB12起始密码子下游第307bp处，此处碱基为T的为粉果番茄，此处碱基为C的为红果番茄。InDel-p是位于SlMYB12基因起始密码子上游约4kb处大小为603bp的序列，该序列缺失的为粉果番茄。InDel-i位于SlMYB12基因起始密码子下游第248bp处，该位点后有一个A插入的为粉果番茄。本发明专利技术的分子标记可应用于番茄分子标记辅助育种中，大大加快番茄的育种进程。
【技术实现步骤摘要】
与番茄果实颜色性状相关的分子标记及应用
本专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及与番茄果实颜色性状相关的分子标记。
技术介绍
番茄果实颜色是一个重要的农艺性状，同时直接影响着消费者的需求。早期经典遗传试验证明番茄果实的颜色由果皮和果肉颜色共同决定，番茄果皮的颜色分为黄色和透明两种，由y基因决定，黄色果皮对无色果皮为显性，黄色果皮的产生是因为果实在成熟过程中果皮中大量积累黄色的类黄酮类物质，无色果皮中缺少该物质的积累。果肉的颜色主要由红色和黄色，由r基因控制，不同颜色果皮和果肉的组合会产生不同外观颜色的果实。栽培番茄的果肉多为红色，因为果皮颜色的不同出现了红果和粉果两种。前人的研究表明，控制果皮颜色的y基因是一个转录因子SlMYB12,此基因的表达导致番茄果皮中积累大量类黄酮而为黄色，最终果实呈现为红色，粉果的果皮中因没有类黄酮的积累而呈现粉色。但是影响该基因表达的关键位点却一直没有发现,目前为止，尚未发现与果皮颜色直接相关的分子标记。在我国番茄的消费以鲜食为主，粉果番茄因其果皮较薄、质地松软、口感较佳而受到消费者的青睐。现在育种中，对不同果实材料的筛选由于缺少与果皮颜色控制基因相关的分子标记，往往借助成熟期表型鉴定的传统方法，这种方法具有很强的滞后性，并且耗费大量的人力和物力。开发与果皮颜色相关的分子标记，不仅从苗期就可完成果实颜色的鉴定，同时可以大规模地对不同材料进行筛选，具有重要的应用价值和社会效益。随着分子数量遗传学、分子生物学技术的飞速发展，有关分子遗传标记和标记辅助选择的研究广泛开展，并在植物育种中应用，产生了巨大的影响。InDel(insertion-deletion)插入缺失标记，此类标记的设计是根据在等位基因位点上一定数量的核苷酸插入或缺失而产生的长度多态性变异，根据发生插入或缺失位点的两侧保守序列分别设计引物，进行该区域的PCR扩增，即为InDel标记。SNP(singlenucleotidepolymorphism)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，此类标记因具有广泛的基因组分布性，同时可进行大规模群体筛选。SNP检测技术主要包括因芯片技术、Taqman技术、分子信标技术和焦磷酸测序法等，随着检测技术的不断进步，SNP标记得到了更为广泛的应用。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良作物的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为农作物育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在农作物育种中的作用将日益突出。在番茄育种中，育种专家希望选择与番茄果实颜色密切相关的DNA标记，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而加快遗传育种进程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一套与番茄果实颜色性状高度相关的分子标记及应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的与番茄果实颜色性状相关的分子标记，包含2个SNP标记和2个InDel标记：第1个SNP标记SNP-p位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游第8616bp处，此处碱基为C的为一般为红果番茄，此处碱基为A的一般为粉果番茄；第2个SNP标记SNP-s位于番茄SlMYB12基因起始密码子下游第307bp处，此处碱基为C的为红果番茄，此处碱基为T的为粉果番茄；第1个InDel标记InDel-p是位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游约4kb处大小为603bp的DNA序列，该序列缺失的为粉果番茄；所述序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；第2个InDel标记InDel-i位于番茄SlMYB12基因起始密码子下游第248bp处，该位点后具有一个A插入的为粉果番茄。本专利技术还提供用于检测上述分子标记的特异性引物对，其中：用于检测标记SNP-p的特异性引物对为：正向引物F5’-GCCTTCTTCTACACCCTT-3’(SeqIDNo.2)反向引物R5’-ACACCAGTGCTCCTCCTA-3’(SeqIDNo.3)。用于检测标记SNP-s和标记InDel-i的特异性引物对为：正向引物F5’-AATAATGGGAAGAACACC-3’(SeqIDNo.4)反向引物R5’-TTCTGGACCTAGACTAAA-3’(SeqIDNo.5)。用于检测标记InDel-p的特异性引物对为：正向引物F5’-AGTGACGAACAACCGACCTA-3’’(SeqIDNo.6)反向引物R5’-CCTCACAAACGCGGACAAA-3’(SeqIDNo.7)。本专利技术还提供一种鉴定番茄果实颜色的方法，包括以下步骤：1)提取待测番茄的基因组DNA；2)以待测番茄的基因组DNA为模板，利用用于检测上述分子标记的特异性引物对，进行PCR扩增反应；3)检测PCR扩增产物。前述的方法，步骤2)中利用用于检测标记SNP-p的特异性引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为：含1.5mmol/LMg2+的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mMdNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μlTaqDNA聚合酶0.4μl，20ng/μlDNA模板2μl，ddH2O补齐至20μl。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条398bp大小的条带，说明扩增出特异性的目的条带，相关序列进行焦磷酸测序，如果目的条带的207bp处为C，表明待测番茄极有可能是红果，若目的条带的207bp处为A，表明待测番茄极有可能是粉果。前述的方法，步骤2)中利用用于检测标记SNP-s和标记InDel-i的特异性引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为：含1.5mmol/LMg2+的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mMdNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μlTaqDNA聚合酶0.4μl，20ng/μlDNA模板2μl，ddH2O补齐至20μl。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条439bp大小的条带，说明扩增出特异性的目的条带，相关序列进行焦磷酸测序，目的条带在251处有碱基A插入的待测番茄为粉果；或者在311bp处碱基为T的待测番茄为粉果，在311bp处碱基为C的待测番茄为红果。前述的方法，步骤2)中利用用于检测标记InDel-p的特异性引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为：含1.5mmol/LMg2+的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mMdNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μlTaqDNA聚合酶0.4μl，20ng/μlDNA模板2μl，ddH2O补齐至20μl。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条360bp大小的条带，表明待测番茄为粉果，如果检测结果仅含本文档来自技高网...
【技术保护点】
与番茄果实颜色性状相关的分子标记，其特征在于，包含2个SNP标记和2个InDel标记；第1个SNP标记SNP‑p位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游第8616bp处，此处碱基为C的为红果番茄，此处碱基为A的为粉果番茄；第2个SNP标记SNP‑s位于番茄SlMYB12基因起始密码子下游第307bp处，此处碱基为C的为红果番茄，此处碱基为T的为粉果番茄；第1个InDel标记InDel‑p是位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游4kb处大小为603bp的DNA序列，该序列缺失的为粉果番茄；所述序列的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；第2个InDel标记InDel‑i位于番茄SlMYB12基因起始密码子下游第248bp处，该位点后具有一个A插入的为粉果番茄。
【技术特征摘要】
1.与番茄果实颜色性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为番茄SlMYB12基因上如SeqIDNo.8所示的DNA序列，所述DNA序列第207bp处存在一个SNP位点，此处碱基为C或A，此处碱基为C的对应于红果番茄，此处碱基为A的对应于粉果番茄；所述SNP位点位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游第8616bp处。2.与番茄果实颜色性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为InDel标记InDel-p；所述标记InDel-p是位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游4kb处大小为603bp的DNA序列，该序列缺失的为粉果番茄；所述序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。3.用于检测权利要求1所述分子标记的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括：正向引物F5’-GCCTTCTTCTACACCCTT-3’和反向引物R5’-ACACCAGTGCTCCTCCTA-3’。4.用于检测权利要求2所述分子标记的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括：正向引物F5’-AGTGACGAACAACCGACCTA-3’和反向引物R5’-CCTCACAAACGCGGACAAA-3’。5.一种鉴定番茄果实颜色的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测番茄的基因组DNA；2)以待测番茄的基因组DNA为模板，利用权利要求3或4的引物对，进行PCR扩增反应；3)...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄三文，祝光涛，林涛，张俊红，伦尧尧，杜永臣，王孝宣，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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