一种从葡萄成熟果实中提取总RNA的方法技术

本发明专利技术提供了一种从葡萄成熟果实中提取总RNA的方法，具体是利用CTAB、氯仿抽提，酸性水饱和酚纯化的步骤从葡萄成熟果实中提取总RNA的方法。本发明专利技术在传统CTAB法提取液中加入了聚乙烯吡咯烷酮、亚精胺、β-巯基乙醇及高浓度的氯化钠，既能高效抑制RNA酶的活性，又能有效防止多糖多酚物质对RNA的干扰。提取过程中利用酸性水饱和酚纯化粗提总RNA，既能最大限度地去除与RNA共沉淀的DNA，又能清除残留的蛋白质与多糖。本发明专利技术方法成本较低，稳定性好，提取的RNA样品纯度高、完整性好。

【技术实现步骤摘要】

： 本专利技术涉及植物分子生物学
，具体是从完全成熟后采摘、富含花色素的 葡萄果实组织中提取总RNA的方法。 技术背景： RNA提取是分子生物学的基本技术之一，高质量的RNA是后续进行RT-PCR、荧光定 量PCR、Stem-loopRT-PCR、Northernblot等分子生物学研究的必要前提。目前，已经发 展了多种RNA的提取方法，如异硫氰酸胍法、热硼酸法、十二烷基硫酸钠（SodiumDodecyl Sulfate，SDS)法、十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrimethylammoniumBromide，CTAB)法 等。异硫氰酸胍能强烈抑制组织及提取液中RNase的活性，方法操作简单、产量高、成本低， 但提取的RNA纯度不是很高，需要做进一步纯化。热硼酸法是通过高浓度的硼酸盐抑制氧 化酶，使RNA免受多酚的干扰，且蛋白酶K可降解能氧化酚类和次生物质的酶类，因此获得 的RNA纯度最高，但是该法所需药品多、价格高、操作较复杂、容易被外源RNA酶降解。SDS 法可以去除果实中的多糖和酚类物质，但提取的RNA纯度仍不是很高。而CTAB法能较好地 解决以上4种方法中存在的问题，所提取的总RNA完整性最好，获得的数量也比较大，且所 需药品简单，是提取果实总RNA较有效的一种方法。 葡萄果实是一种富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织。酚类化合物在匀浆时 极易被氧化成醌类物质，与RNA不可逆地结合，从而影响RNA的分离纯化。多糖的理化性质 与RNA相似，在提取过程中能与RNA共沉淀，很难将它们分开，这些都会严重影响到RNA的 提取质量。随着贮藏时间的延长，葡萄果实中酚类化合物及次生代谢物的含量也随之增加， 使得RNA的提取更加困难。采用传统的CTAB法已经不能实现从葡萄成熟果实中提取高质 量的总RNA。
技术实现思路
： 本专利技术的目的是建立一种简便，易行，效果良好的从葡萄果实中提取总RNA的方 法，有效解决从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总RNA的难题。 本专利技术经过大量的实验，研究出了适用于从完全成熟的、富含花色素的、不同贮藏 期间的葡萄果实组织中提取总RNA的方法，具体包括如下步骤： (1)吸取RNA提取液于离心管中，65°C预热；所述的RNA提取液组份为：2% (W/V) 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)，2% (W/V)聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K40)，100mmol .L1三羟 甲基氨基甲烷（1^8-11(：1，？118.0)，100111111〇1吨1乙二胺四乙酸伍0丁厶，？118.0)，2.5111〇1吨1 氯化钠（似(：1)，0.58，1/亚精胺； (2)按每1克葡萄果实加入10毫升RNA提取液的比例，称取葡萄果实，迅速转移至 用液氮预冷的研钵中，充分研磨直至成粉末状； (3)向步骤（1)中预热的RNA提取液中加入少许巯基乙醇，迅速将葡萄果实粉 末转移至离心管中，晃动离心管，使液氮完全挥发，盖住离心管盖，剧烈震荡混匀，60-65°C 孵育 10-20min; (4)加入等体积的体积比为24 :1的氯仿-异戊醇，涡旋混匀；于4°C，8500rpm离 心15-25min，取上清至新的离心管中； (5)重复步骤（4) 2-3 次； (6)在上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀后于4°C放置0. 5-lh;之后4°C， 8500rpm离心20-30min，去上清，得到透明胶状RNA粗提沉淀； (7)用DEPC水配制的75-90 %乙醇清洗沉淀2次，室温下风干，将沉淀溶于DEPC 水中得到RNA溶液； (8)在RNA溶液中加入等体积的体积比为5:1的酸性酚-氯仿，涡旋混匀， 14000rpm，4°C离心10_20min，取上清置于新的离心管中； (9)重复步骤（8) 1次； (10)在上清液中加入5mol?LWaCl溶液和体积比为24:1的氯仿-异戊醇，涡旋 混勾，14000rpm，4°C离心10_15min，将上清转移至新的离心管中； (11)在上清液中加入等体积的异丙醇，混匀后于4°C放置0. 5-lh沉淀RNA;之后 4°C，8500rpm离心20-30min，去上清，得到透明胶状RNA沉淀； (12)用DEPC7K配制的75-90 %乙醇清洗RNA沉淀2次，室温下风干，将沉淀溶于 DEPC水中。 所述的RNA提取液中的亚精胺可用三盐酸精脒代替。所述步骤（8)中的酸性酚为 pH值为4. 5 ±0. 2的水饱和酚。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果： 在本专利技术中，亚精胺作为RNase抑制剂，有效地保证了RNA的完整性。 在RNA提取液中加入可溶性PVP(K40)，PVP能与酚类物质充分结合形成螯合物，通 过氯仿抽提将其除去，有效阻止酚类物质与RNA结合。 于加样前在预热的提取液中加入强还原剂0 -巯基乙醇，与PVP协同作用，有效抑 制了酚类物质的氧化，这种处理比在提取液中单独加入0 _巯基乙醇或PVP的效果要好。 提高RNA提取液中NaCl的浓度为2. 5mol?L\在高浓度NaCl溶液中，由于溶解 度差异，CTAB与多糖形成复合物沉淀，以有效去除多糖。 酸性酚在酸性条件下，RNA被分配于水相，DNA和蛋白质在有机相，从而最大限度 的除去蛋白和DNA，提高RNA的产率和纯度。 本专利技术的方法经济、稳定，提取的RNA样品纯度高、完整性好，适用于从葡萄成熟 果实中提取总RNA。【附图说明】： 图1为玫瑰香葡萄果实贮藏期间对照组与302保鲜组总RNA的凝胶电泳图。泳道 1 :贮藏初期葡萄果实总RNA;泳道2、4 :对照组在贮藏20d、60d后葡萄果实总RNA;泳道3、 5 :S02保鲜组在贮藏20d、60d后葡萄果实总RNA。图2为玫瑰香葡萄果实不同贮藏时期对照组与S02保鲜组中相关基因的RT-PCR分 析。【具体实施方式】： 实施例1 : 玫瑰香葡萄果实不同贮藏时期对照组与302保鲜组总RNA提取 (1)吸取2ml提取液于离心管中，65°C预热；RNA提取液组份为：2% (W/V)十六烷 基三甲基溴化铵（CTAB)，2% (W/V)聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K40)，100mmol?L1三羟甲基氨 基甲烷（Tris-HCl，pH8. 0)，lOOmmol?L1乙二胺四乙酸（EDTA，pH8. 0)，2. 5mol?L1氯化 钠（NaCl)，0. 5g?L1亚精胺。 (2)取液氮速冻的不同贮藏时期对照组与S02保鲜组（贮藏初期、贮藏20d和60d) 玫瑰香葡萄果实各200mg左右，在液氮中将其研磨成粉末。 (3)向向步骤⑴中预热的RNA提取液中加入25yL0 -巯基乙醇，迅速将葡萄果 实粉末转移至离心管中，晃动离心管，使液氮完全挥当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从葡萄成熟果实中提取总RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)吸取RNA提取液于离心管中，65℃预热；所述的RNA提取液组份为：2％十六烷基三甲基溴化铵，2％聚乙烯吡咯烷酮，pH为8.0的100mmol·L‑1三羟甲基氨基甲烷，pH为8.0的100mmol·L‑1乙二胺四乙酸，2.5mol·L‑1氯化钠，0.5g·L‑1亚精胺；(2)按每1克葡萄果实加入10毫升RNA提取液的比例，称取葡萄果实，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，充分研磨直至成粉末状；(3)向步骤(1)中预热的RNA提取液中加入少许β‑巯基乙醇，迅速将葡萄果实粉末转移至离心管中，晃动离心管，使液氮完全挥发，盖住离心管盖，剧烈震荡混匀，60‑65℃孵育10‑20min；(4)加入等体积的体积比为24：1的氯仿‑异戊醇，涡旋混匀；于4℃，8500rpm离心15‑25min，取上清至新的离心管中；(5)重复步骤(4)2‑3次；(6)在上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀后于4℃放置0.5‑1h；之后4℃，8500rpm离心20‑30min，弃上清，得到透明胶状RNA粗提沉淀；(7)用DEPC水配制的75‑90％乙醇清洗沉淀2次，室温下风干，将沉淀溶于DEPC水中得到RNA溶液；(8)在RNA溶液中加入等体积的体积比为5:1的酸性酚‑氯仿，涡旋混匀，14000rpm，4℃离心10‑20min，取上清置于新的离心管中；(9)重复步骤(8)1次；(10)在上清液中加入5mol·L‑1NaCl溶液和体积比为24：1的氯仿‑异戊醇，涡旋混匀，14000rpm，4℃离心10‑15min，将上清转移至新的离心管中；(11)在上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀后于4℃放置0.5‑1h沉淀RNA；之后4℃，8500rpm离心20‑30min，弃上清，得到透明胶状RNA沉淀；(12)用DEPC水配制的75‑90％乙醇清洗RNA沉淀2次，室温下风干，将沉淀溶于DEPC水中。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛美昭，仪慧兰，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14