一种基于Zmend1a基因调节水稻籽粒大小和淀粉含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于Zmend1a基因调节水稻籽粒大小和淀粉含量的方法，所述Zmend1a基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子，所述方法为：构建Zmend1a基因过量表达载体，并将过量表达载体导入目的水稻基因组中，得到籽粒直链淀粉含量以及直链淀粉/总淀粉比例均低于目的水稻的Zmend1a基因过量表达植株。该方法利用Zmend1a基因对植物籽粒淀粉合成相关基因的负调控作用，通过基因工程的方法改变水稻籽粒中直链淀粉含量和直链淀粉/总淀粉比例，获得具有高支链淀粉的转基因水稻新品种，对利用基因工程技术开发具有特定功能的转基因水稻新品种具有重要的实践意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于Zmend1a基因调节水稻籽粒大小和淀粉含量的方法
本专利技术涉及的是基因工程的
，尤其涉及的是一种基于Zmend1a基因调节水稻籽粒大小和淀粉含量的方法。
技术介绍
淀粉是植物种子的主要组成部分，作为光合作用的最终产物，是取之不尽用之不竭的天然材料。淀粉不仅可以作为粮食、饲料，而且是重要的工业原材料，广泛用于食品、化工、能源、机械、建筑、制药等行业。水稻中，淀粉为水稻胚乳的主要组成成分，其含量和品质直接影响着水稻种子的品质。淀粉根据结构不同分为直链淀粉和支链淀粉，淀粉中直链淀粉和支链淀粉的比例以及支链淀粉的分支链结构决定着水稻的品质，同时直链淀粉和直链淀粉之间的比例还决定着淀粉的用途。直链淀粉生产的可再生、可降解膜应用于农用薄膜加工业和包装工业，可以减少工业废气及减弱温室效应气体的释放，高直链淀粉还是生产光解塑料的最佳原料，用于一次性餐具，是解决日益严重的“白色污染”的有效途径；支链淀粉具有更好的薪性，可增加膨化食品的体积，作为食品添加剂具有不同于直链淀粉的效果，在黏合剂领域具有较多应用。在禾谷类胚乳中淀粉的合成是一个多酶催化的复杂过程，主要涉及四大类酶：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SSs)、淀粉分支酶(SBEs)、淀粉去分支酶(DBEs)。这四大类酶都包括许多家族成员，各成员又有精细分工，在淀粉合成过程中发挥不同的作用。直链淀粉是由α-1,4糖普键连接的线性多聚物，通常只含有很小程度的分支。在正常作物种子中，直链淀粉约占储藏淀粉的20-30％，它对于淀粉颗粒的形成并非必要。淀粉的颗粒结构主要是由于支链淀粉的折叠而形成的。AGPase是淀粉合成过程中非常关键的酶，因此其对其活性的影响会直接影响到淀粉的合成。淀粉合成酶是通过催化α-1,4-葡聚糖链，在ADP-葡萄糖上不断的添加寡聚糖，从而实现葡聚糖链的延伸。根据淀粉体中存在的状态，可分为颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-boundstarchsynthase，GBSS)和可溶性淀粉合成酶(Solublestarchsynthase，SSS)。直链淀粉主要是由颗粒结合型淀粉合成酶GBSSI负责合成的。淀粉合成酶将ADPG(ADP-葡萄糖)中的葡萄糖基添加到支链淀粉的分支链或直链淀粉的非还原性末端。淀粉合成酶可分为5个家族：SSI、SSII、SSIII、SSIV和GBSS。它们分别延伸支链淀粉中不同聚合度的支链，或者延伸线性的直链淀粉链。GBSS家族有两个成员：GBSSI和GBSSII。GBSSI由Wx基因编码，主要负责胚乳和花粉粒中直链淀粉的合成。GBSSII主要在叶片中表达，负责非储藏器官中的直链淀粉的合成。在玉米、小麦、水稻、马铃薯的GBSSI缺失突变体中，贮藏器官淀粉粒中仅含有支链淀粉组分，几乎不含有直链淀粉成分。GBSSI是唯一能够连续地延伸直链淀粉的淀粉合成酶，生成长的寡糖链。多糖链的分支通过淀粉分支酶来实现，在淀粉分支酶(SBE)催化作用下，剪切掉多糖链内部的α-1,4糖苷键，释放还原端，产生一个α-1，6糖苷键，结合上可溶性糖链形成分支。SBE在支链淀粉合成过程中扮演着不同的角色，由于直链淀粉分支较少，SBE在直链淀粉的分支过程中也一定起重要作用。淀粉去分支酶的功能是去除一些不规则的分支。对玉米、水稻和拟南芥的ISA酶突变体分析发现，该酶的突变能直接导致淀粉含量的降低，不正常的淀粉结构、颗粒形态和植物糖原的积累，而PUL主要在淀粉降解过程中起作用，然而在淀粉合成过程中也起作用，其突变影响淀粉含量和结构。综上，通过基因工程手段培育直链淀粉和支链淀粉的比例各不相同的植物对于淀粉工业化生产是迫切需要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于Zmend1a基因调节水稻籽粒大小和淀粉含量的方法，以提供一种能够降低水稻籽粒直链淀粉/总淀粉比例，提高支链淀粉/总淀粉比例的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种基于Zmend1a基因调节水稻籽粒大小和淀粉含量的方法，所述Zmend1a基因为下述i)或ii)的DNA分子：i)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的DNA分子；ii)核苷酸序列与SEQIDNO.1至少具有98％同一性且编码如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的DNA分子；所述方法为：以人工合成或基因克隆方法获得所述Zmend1a基因，构建Zmend1a基因过量表达载体，并将过量表达载体导入目的水稻基因组中，得到Zmend1a基因过量表达植株，所述过量表达植株籽粒直链淀粉含量以及直链淀粉/总淀粉比例均低于目的水稻(支链淀粉/总淀粉比例高于目的水稻)，相比较目的水稻具有更好的薪性，可应用在食品添加剂或粘合剂等领域。所述Zmend1a基因的获得方法为基因克隆法，具体步骤包括：提取玉米籽粒胚乳RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，根据Zmend1a基因序列设计特异性扩增引物，进行PCR扩增。进一步地，所述特异性扩增引物序列为：End1a-F：5′-ATGGACGAGGACCGGAGCGCC-3′End1a-R：5′-TCGATGGTTCCACTGCTTTTGCTGAGC-3′进一步地，所述步骤(2)中，Zmend1a基因过量表达载体为多克隆位点区域依次连接有35S启动子、Zmend1a基因和终止子的pCAMBIA1301植物表达载体。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术提供了一种基于Zmend1a基因调节水稻籽粒大小和淀粉含量的方法，该方法利用Zmend1a基因对植物籽粒淀粉合成相关基因的负调控作用，通过基因工程的方法改变水稻籽粒中直链淀粉含量和直链淀粉/总淀粉比例，获得具有高支链淀粉的转基因水稻新品种，对利用基因工程技术开发具有特定功能的转基因水稻新品种具有重要的实践意义。附图说明图1为pEASY-T1载体图谱；图2为pCAMBIA1301载体图谱；图3为Zmend1a转基因水稻籽粒大小和千粒重测定结果柱状图；其中图3a为水稻籽粒大小测定结果，图3b为水稻籽粒千粒重测定结果；WT为野生型植株，L1-4为过量表达植株；图4为Zmend1a转基因水稻籽粒直链淀粉和总淀粉含量柱状图；其中图4a为直链淀粉含量，图4b为总淀粉含量；WT为野生型植株，L1-6为过量表达植株。具体实施方式实施例11、材料本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。2、方法2.1Zmend1a基因的获得选取玉米B73品种授粉后16天的籽粒胚乳，提取玉米胚乳RNA并反转录成cDNA，以玉米胚乳cDNA为模板，根据Zmend1a基因序列和玉米B73基因组数据库，结合植物表达载体的多克隆位点设计引物End1a–F-1、End1a–R-1，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。引物序列为：End1a–F-1：5′-GGGGTACCATGGACGAGGACCGGAGCGCC-3′End1a–R-1：5′-AACTGCAGTCGATGGTTCCACTGCTTTTGCTGAGC-3′PCR反应程序为：98℃，预变性10min；98℃，变性20s；65℃，退火20s；72℃，延伸2min，30个循环；72℃，复性10min；10℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Zmend1a基因调节水稻籽粒大小和淀粉含量的方法，其特征在于，所述Zmend1a基因为下述i)或ii)的DNA分子：i)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；ii)核苷酸序列与SEQ ID NO.1至少具有98％同一性且编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的DNA分子；所述方法为：以人工合成或基因克隆方法获得所述Zmend1a基因，构建Zmend1a基因过量表达载体，并将过量表达载体导入目的水稻基因组中，得到Zmend1a基因过量表达植株。

【技术特征摘要】
1.一种基于Zmend1a基因调节水稻籽粒大小和淀粉含量的方法，其特征在于，所述Zmend1a基因为下述i)或ii)的DNA分子：i)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的DNA分子；ii)核苷酸序列与SEQIDNO.1至少具有98％同一性且编码如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的DNA分子；所述方法为：以人工合成或基因克隆方法获得所述Zmend1a基因，构建Zmend1a基因过量表达载体，并将过量表达载体导入目的水稻基因组中，得到Zmend1a基因过量表达植株。2.根据权利要求1所述的一种基于Zmend1a基因调节水稻籽粒大小和淀粉含量的方法，其特征在于，所述Zmend1a基因的获得方法为基因克隆法，具体步骤包括：提取玉米籽...

【专利技术属性】
技术研发人员：程备久，董庆，武建东，项艳，江海洋，周伟，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34