一种mRNA的正义链的整体扩增方法技术

本发明专利技术涉及一种整体扩增mRNA的正义链的方法，解决了常规的mRNA提取方法不足以满足实验所需用量的问题，步骤如下：a.合成12种寡核苷酸，每种寡核苷酸的序列为4部分，从5’端开始，第1部分为一段通用模板序列，作为后续扩增反应时引物结合的模板，第2部分为A、C两个碱基，第3部分为重复T寡核苷酸，第4部分2个碱基为G或A或C与G或A或C或T的随机组合；b.将12种寡核苷酸混合；c.将总RNA与寡核苷酸混合液、逆转录酶和逆转录缓冲液混合，进行逆转录反应，并在反应过程中间阶段加入寡核苷酸Cap，继续进行逆转录反应；d.逆转录产物为模板，寡核苷酸P1、P2为引物进行扩增。

【技术实现步骤摘要】
一种mRNA的正义链的整体扩增方法
本专利技术涉及RNA的扩增
，具体指一种mRNA的正义链的整体扩增方法。
技术介绍
众所周知，信使核糖核酸(MessengerRNA，mRNA)是从脱氧核糖核酸(DNA)转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸(RNA)，它在核糖体上作为蛋白质合成的模板指导蛋白质合成，决定肽链的氨基酸排列顺序，是承载生物遗传信息的重要载体，是参与生命活动多重要分子。但是，当科学研究过程中需要获得非常大量的mRNA时，或可用于提取mRNA的标本量极少时，常规的mRNA提取方法不足以满足实验所需用量，这种情况下，为了获得足够量的mRNA，需要对从标本中提取获得的mRNA进行整体扩增。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种整体扩增mRNA的正义链的方法，在保证mRNA分子完整性的同时解决了常规的mRNA提取方法不足以满足实验所需用量的问题。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种整体扩增mRNA的正义链的方法，包括如下步骤：a.分别合成以下寡核苷酸：12种寡核苷酸Oligo-1～Oligo-12，其每种寡核苷酸的序列分为4个部分，从5’端开始，第1部分为一段通用模板序列，可以作为后续扩增反应时引物结合的模板，第2部分为A、C两个碱基，第3部分为重复T寡核苷酸，第4部分2个碱基为G或A或C与G或A或C或T的随机组合；寡核苷酸Cap，其寡核苷酸的序列分为3个部分，从5’端开始，第1部分为RNA聚合酶的启动子序列，第2部分为C，第3部分为GGG；寡核苷酸P1，其寡核苷酸的序列分为3个部分，从5’端开始，第1部分为一段通用模板序列，第2部分为RNA聚合酶的启动子序列，第3部分为C；寡核苷酸P2；其寡核苷酸的序列，从5’端开始，为RNA聚合酶的启动子序列；b.将步骤a制备的12种寡核苷酸Oligo-1～Oligo-12分别取相同摩尔量混合，制得每种寡核苷酸浓度含量相同的寡核苷酸混合液；c.将从标本中提取的总RNA与步骤b制得的寡核苷酸混合液、逆转录酶和逆转录缓冲液混合，进行逆转录反应，并在反应过程中间阶段加入步骤a制备的寡核苷酸Cap，继续进行逆转录反应；d.以步骤c获得的逆转录产物为模板，以步骤a中制备的寡核苷酸P1、P2为引物进行PCR扩增，扩增产物经DNA纯化后回收。进一步的，步骤c中的标本中提取的总RNA的反应体系为0.1～2.0μg/20μl反应体系，优选1.0μg/20μl反应体系。根据实施例1-4，分别选用0.1ug(实施例1-2)、1ug(实施例3)、2ug(实施例4)进行了试验，结果表明，0.1ug时产物含量较少、1ug时产物含量相对增多、2ug时产物含量并未比1ug时显著增加。进一步的，步骤c中的获得的寡核苷酸混合液反应体系为0.1～2μl/20μl，优选1.0μl/20μl反应体系。寡核苷酸用量过少会导致逆转录不充分、用量过多会导致非特异性产物增加或引物二聚体生成。进一步的，步骤a中获得的寡核苷酸Cap配制为终浓度为120μM的溶液，在步骤c中获得的逆转录反应过程中间阶段加入寡核苷酸Cap反应体系为0.1～2μl/20μ，优选1.0μl/20μl反应体系，其用量与寡核苷酸混合液用量相对应。进一步的，所述的逆转录反应通过逆转录酶实现，主要为M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶，优选M-MLV逆转录酶。进一步的，所述的整体扩增反应通过DNA聚合酶实现，主要为TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、VentDNA聚合酶或PfuDNA聚合酶，优选TaqDNA聚合酶。进一步的，所述的体外转录反应通过T7RNA聚合酶实现。进一步的，所述的DNA纯化反应通过无水乙醇/醋酸钠沉淀法实现。进一步的，所述的RNA纯化反应通过酚/氯仿/异戊醇萃取法实现。本专利技术方法具有以下优越性：1、保证mRNA分子完整性。2、通过扩增获得大量的mRNA。附图说明图1是实施例2、实施例3、实施例4中起始总RNA量和整体扩增获得DNA产物量对比图。图2是实施例5、实施例6中起始整体扩增产物量和体外转录获得RNA产物量对比图。具体实施方式以下借助实施例，对本专利技术进行具体说明，但本专利技术并不限于此。本领域的技术人员在不超出本专利技术的范围内，可进行各种变更、修正及改变。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1：按照要求设计并合成所需寡核苷酸按照要求设计并合成所需寡核苷酸，具体序列见表1。表1寡核苷酸序列将寡核苷酸Oligo-1～Oligo-12按等摩尔比1:1混合，使最终混合液中每种寡核苷酸终浓度均为10μM。实施例2：逆转录及整体扩增反应1(1)逆转录反应：反应总体系20μl。其中，标本中提取的总RNA0.1μg，寡核苷酸混合液0.1μl，逆转录反应如下：标本中提取的总RNA0.1μg寡核苷酸混合液(10μM)0.1μlddH2O补至5μl轻柔吹打混匀，70℃水浴5min，立即置于冰上5min。然后加入：反应条件如下：25℃水浴5min，42℃水浴30min然后加入：寡核苷酸Cap(120μM)0.1μl42℃水浴30min，70℃水浴15min。(2)逆转录产物的整体扩增：反应总体系20μl。逆转录产物的整体扩增反应如下：PCR扩增反应过程如下：(a)98℃预变性3min，，(b)98℃变性20s，(c)60℃退火20s，(d)72℃延伸10min，(e)重复(b)-(d)20个循环，(f)72℃延伸10min使用无水乙醇/醋酸钠沉淀法纯化DNA。测量DNA产物含量。所获得DNA产物含量为29.7μg实施例3：逆转录及整体扩增反应2逆转录反应中标本中提取的总RNA为1.0μg，寡核苷酸混合液为1.0μl，寡核苷酸Cap为1.0μl，其他条件同前。所获得DNA产物含量为63.6μg实施例4：逆转录及整体扩增反应3逆转录反应中标本中提取的总RNA为2.0μg，寡核苷酸混合液为2.0μl，寡核苷酸Cap为2.0μl，其他条件同前。所获得DNA产物含量为67.7μg实施例5：扩增产物的体外转录1总反体系20μl，扩增产物的体外转录反应如下：37℃水浴30min。然后加入：DNA降解酶1U37℃水浴15min。使用酚/氯仿/异戊醇萃取法纯化RNA。测量RNA产物含量。所获得RNA产物含量为112.4μg实施例6：扩增产物的体外转录2总反体系40μl，扩增产物的体外转录反应如下：37℃水浴30min。然后加入：DNA降解酶2U37℃水浴15min。使用酚/氯仿/异戊醇萃取法纯化RNA。测量RNA产物含量。所获得RNA产物含量为298.3μg以上数据表明：本方法首先将起始总RNA逆转录为DNA并将逆转录产物进行整体扩增，从而获得大量整体扩增DNA产物，然后将整体扩增的DNA体外转录为mRNA，从而获得大量的mRNA。本方法可以大量扩增mRNA正义链，解决了常规的mRNA提取方法不足以满足实验所需用量的问题。SEQUENCELISTING<110>吉林大学<120>一种mRNA的整体扩增方法<130>2010<160>15<170>PatentInversion3.5<210&g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种mRNA的整体扩增方法，其特征在于包括如下步骤：a.分别合成以下寡核苷酸：12种寡核苷酸Oligo‑1～Oligo‑12，其每种寡核苷酸的序列分为4个部分，从5’端开始，第1部分为一段通用模板序列，可以作为后续扩增反应时引物结合的模板，第2部分为A、C两个碱基，第3部分为重复T寡核苷酸，第4部分2个碱基为G或A或C与G或A或C或T的随机组合；寡核苷酸Cap，其寡核苷酸的序列分为3个部分，从5’端开始，第1部分为RNA聚合酶的启动子序列，第2部分为C，第3部分为GGG；寡核苷酸P1，其寡核苷酸的序列分为3个部分，从5’端开始，第1部分为一段通用模板序列，第2部分为RNA聚合酶的启动子序列，第3部分为C；寡核苷酸P2；其寡核苷酸的序列，从5’端开始，为RNA聚合酶的启动子序列；b.将步骤a制备的12种寡核苷酸Oligo‑1～Oligo‑12分别取相同摩尔量混合，配制成每种寡核苷酸浓度含量相同的寡核苷酸混合液；c.将从标本中提取的总RNA与步骤b制得的寡核苷酸混合液、逆转录酶和逆转录缓冲液混合，进行逆转录反应，并在反应过程总时间的中间点加入步骤a制备的寡核苷酸Cap，继续进行逆转录反应；d.以步骤c获得的逆转录产物为模板，以步骤a中制备的寡核苷酸P1、P2为引物进行PCR扩增，扩增产物经DNA纯化后回收；e.将步骤e所获得的扩增产物与RNA聚合酶和体外转录缓冲液混合，进行体外转录反应，体外转录产物经RNA纯化后回收，回收产物即为整体扩增的mRNA。...

【技术特征摘要】
1.一种mRNA的整体扩增方法，其特征在于包括如下步骤：a.分别合成以下寡核苷酸：12种寡核苷酸Oligo-1～Oligo-12，其每种寡核苷酸的序列分为4个部分，从5’端开始，第1部分为一段通用模板序列，可以作为后续扩增反应时引物结合的模板，第2部分为A、C两个碱基，第3部分为重复T寡核苷酸，第4部分2个碱基为G或A或C与G或A或C或T的随机组合；寡核苷酸Cap，其寡核苷酸的序列分为3个部分，从5’端开始，第1部分为RNA聚合酶的启动子序列，第2部分为C，第3部分为GGG；寡核苷酸P1，其寡核苷酸的序列分为3个部分，从5’端开始，第1部分为一段通用模板序列，第2部分为RNA聚合酶的启动子序列，第3部分为C；寡核苷酸P2；其寡核苷酸的序列，从5’端开始，为RNA聚合酶的启动子序列；b.将步骤a制备的12种寡核苷酸Oligo-1～Oligo-12分别取相同摩尔量混合，配制成每种寡核苷酸浓度含量相同的寡核苷酸混合液；c.将从标本中提取的总RNA与步骤b制得的寡核苷酸混合液、逆转录酶和逆转录缓冲液混合，进行逆转录反应，并在反应过程总时间的中间点加入步骤a制备的寡核苷酸Cap，继续进行逆转录反应；d.以步骤c获得的逆转录产物为模板，以步骤a中制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨麒巍，张桂珍，杜珍武，宋旸，赵冠杰，任明，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22