The invention discloses a method for GST Pull Down and mass spectrometry technology based on the finding of Rugao yellow chicken gene interaction protein: (1) gene cloning and prokaryotic expression vector construction; (2) Pet 49 (b) GST gene prokaryotic fusion expression vector construction; (3) Pet 49 (b) of prokaryotic expression GST gene; (4) a large number of bacteria to detect the protein expression and breaking; (5) expressed protein on the expression of the position after the protein was purified and concentrated by Pull Down and GST test; (6) GST Pull Down protein protein interaction with the protein sequence of reductive alkylation and digested and the target gene was acquired by LC MS/MS identification. The invention can obtain the interaction protein of the related gene quickly; the method is simple and easy to use; the repeatability is strong; the method can be carried out in an ordinary laboratory.
【技术实现步骤摘要】
一种基于GST-PullDown以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法
本专利技术涉及分子生物学工程等相关领域。技术背景GSTPull-Down试验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种诱饵蛋白，将目的蛋白溶液过柱，从中捕获与之相互作用的目的蛋白，蛋白间的相互作用可以通过SDS-PAGE电泳以及其它相关的检测方法来证实，这些方法包括考马斯亮蓝、银或锌染色、Western-blotting以及放射性同位素32S检测等。李荣等人首先通过互换载体在酵母中证实与KyTo和RBP-J的相互作用。进而在大肠杆菌中表达纯化了KyoT2蛋白,并以此为抗原制备了KyoT2多克隆杭体,通过GST-pulldown试验进一步在体外大肠杆菌中验证了KyoT2和互作蛋白间的相互作用。鲁凌云等人利用GSTpull-down证明了ETARC末端与FLJ在体外相互作用并探讨了ETAR和ETBR与未知蛋白分子的相互作用，从而阐明其对下游信号调...
【技术保护点】
一种基于GST‑Pull Down以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：(1)目的基因克隆以及原核表达载体构建根据如皋黄鸡目的基因的NCBI基因登陆号寻找目的基因的CDS全序列，设计特异性引物并引入EcoR I和Hind III酶切位点，酶切位点根据目的基因的基本信息进行确定，通过PCR方法克隆目的基因CDS全序列，克隆产物纯化后经测序验证，用于后续试验；(2)Pet‑49(b)‑GST‑目的基因的原核融合表达载体构建将步骤(1)测序正确的克隆产物和Pet‑49(b)原核表达载体分别通过EcoR I和Hind III进行双酶切，酶切...
【技术特征摘要】
1.一种基于GST-PullDown以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：(1)目的基因克隆以及原核表达载体构建根据如皋黄鸡目的基因的NCBI基因登陆号寻找目的基因的CDS全序列，设计特异性引物并引入EcoRI和HindIII酶切位点，酶切位点根据目的基因的基本信息进行确定，通过PCR方法克隆目的基因CDS全序列，克隆产物纯化后经测序验证，用于后续试验；(2)Pet-49(b)-GST-目的基因的原核融合表达载体构建将步骤(1)测序正确的克隆产物和Pet-49(b)原核表达载体分别通过EcoRI和HindIII进行双酶切，酶切3h后进行纯化并连接，连接16h后转化DH5α，挑取阳性细菌克隆并提取质粒，通过双酶切和测序对构建的原核融合表达重组质粒进行鉴定，获取构建成功的Pet-49(b)-GST-目的基因质粒；(3)Pet-49(b)-GST-目的基因进行原核表达将步骤(2)获取构建成功的Pet-49(b)-GST-目的基因质粒转化原核达菌种BL，同时利用异丙基硫代半乳糖苷IPTG对BL菌种进行诱导，诱导3h后提取菌液蛋白，通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况，同时利用GST和目的基因基因抗体检测目的蛋白的表达情况；(4)对蛋白进行大量表达和破菌检测；(5)明确蛋白的表达位置后对表达的蛋白进行纯化和浓缩并进行GST-PullDown试验；(6)GST-PullDown后的蛋白进行蛋白质还原烷基化和胶内酶解并通过LC-MS/MS鉴定获取目的基因的互作蛋白的序列。2.根据权利要求1所述的一种基于GST-PullDown以及质谱分析寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法，其特征是，所述步骤(4)蛋白大量表达及破菌检测具体过程为：以300ml为例，取3mLLB液体培养基，加入抗生素；取菌液蛋白室温解冻，充分混匀后，取3μL接种入所述LB培养基中；置于摇床37℃，200rpm，过夜摇菌；将3mL过夜生长的菌液全部接种于300mL含抗生素的LB培养基，37℃，200rpm生长，降温到所需求的诱导温度后加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG进行诱导；4小时后将菌液倒入50mL离心管中，4℃8000rpm离心3min，弃上清；菌体加25mL缓冲液重悬，装入25mL烧杯内；加溶菌酶混匀，V溶菌酶：V菌液＝1:200；冰上30min；冰上超声，工作时间：3h；间隙时间：4s；工作次数：99；功率不超过200w；倒入离心管内，4℃16000rpm离心30min；取样品进行SDS-PAGE检测；剩余上清及沉淀至于0-7℃备用。3.根据权利要求2所述的一种基于GST-PullDown以及质谱分析寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法，其特征是，所述步骤(5)对表达的蛋白进行纯化和浓缩上清蛋白纯化具体过程为：将GST琼脂糖凝胶装入层析柱，用10倍柱床体积的Buffer冲洗；将步骤(4)检测的上清样品加到层析柱中，流速控制在0.5mL/min；层析用10倍柱床体积的Buffer冲洗除杂，流速控制在1mL/min；用10倍柱床体积的GSH缓冲洗脱，流速控制在1mL/min，收集洗脱峰；SDS-PAGE跑胶检测各组分；进行蛋白浓缩。4.根据权利要求1所述的一种基于GST-PullDown以及质谱分析寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：李碧春，左其生，王颖洁，张亚妮，汤贝贝，李东，纪艳芹，连超，王飞，路镇宇，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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