一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法技术
【技术实现步骤摘要】
一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法
本专利技术属于核酸分析与检测领域，具体涉及一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法。
技术介绍
核酸扩增技术在当今的分析检测领域具有十分重要的意义。食品安全检测、环境监控、医疗诊断、法医鉴定等领域无不依赖于核酸扩增技术。最早也是最经典的核酸扩增技术是在耐热性聚合酶的帮助下，依靠温度的不断循环交替而实现模板变性、引物退火及延伸从而实现目标产物的大量积累，这种技术被称作聚合酶链式反应（PCR）。然而，PCR最大的缺陷也就在于，其不断的温度变化过程对仪器（PCR仪）提出了相对高的要求，并进而限制了其扩增速率。恒温扩增的出现彻底摆脱了对精密温控设备的依赖，仅仅一个热块、一台水浴锅甚至一只保温效果良好的保温瓶、热水瓶等即可满足反应需求。常见的恒温扩增技术包括：环介导等温扩增（LAMP）、重组聚合酶扩增（RPA）、链置换扩增（SDA）、依赖解旋酶的扩增（HDA）等等。然而，这些扩增方法反应时间相对较长，或需要多种酶同时工作而造成检测成本高，或需要特定的核苷酸参与而造成高成本、低反应速率等问题。因此，十分需要一种反应速率快、成本低、操作简便的恒...
【技术保护点】
一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）设计两对引物，F1、R1和BF、BR，其中F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶作用区域；（2）选取反应酶，包括具有链取代活性的聚合酶和切口酶，所述聚合酶能够在引物与模板结合之后在引物的3'端加成核苷酸，使得引物的3'不断延伸，并取代原来模板链的互补链；所述切口酶能够识别特异性的核苷酸序列，并在含有此序列的上游、中间、或者下游的双链DNA的其中一条链上产生缺口；（3）选取核酸阻遏物，该核酸阻遏物能够与所述恒温扩增体系的一条产...
【技术特征摘要】
1.一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）设计两对引物，F1、R1和BF、BR，其中F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶作用区域；（2）选取反应酶，包括具有链取代活性的聚合酶和切口酶，所述聚合酶能够在引物与模板结合之后在引物的3'端加成核苷酸，使得引物的3'不断延伸，并取代原来模板链的互补链；所述切口酶能够识别特异性的核苷酸序列，并在含有此序列的上游、中间、或者下游的双链DNA的其中一条链上产生缺口；（3）选取核酸阻遏物，该核酸阻遏物能够与所述恒温扩增体系的一条产物进行互补配对，防止引物与所述产物结合后被聚合酶被过度延伸；（4）所述单链产物的生成方法具体包括以下步骤：（ⅰ）在某些反应温度下，引物F1和BF与同一条模板链结合，引物BF在引物F1的上游，（ⅱ）在聚合酶的作用下，引物F1的3’末端被聚合酶延伸，（ⅲ）在相同的反应温度下，引物BF的3'末端被延伸，并取代F1延伸所得的产物S1，（ⅳ）引物R1和BR与产物S1结合，引物BR在引物R1的上游，（ⅴ）在聚合酶的作用下，引物R1的3’末端被聚合酶延伸，（ⅵ）在相同的反应温度下，引物BR的3'末端被延伸，并取代R1延伸所得的产物P1，（ⅶ）在相同的反应条件下，引物F1与产物P1结合，并在聚合酶的作用下延伸引物的3’末端，（ⅷ）切口酶特异性识别双链DNA产物的切口位点，并在双链区的特异性位点的其中一条DNA链上产生一缺口，（ⅸ）在聚合酶的帮助下，具有缺口的DNA链3'末端继续被延伸，并取代原来的切口位点下游的DNA链，当切口酶浓度较低时，生成产物A1，当切口相对过量时，生成产物E1，（ⅹ）引物R1的识...
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