一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法技术

本发明专利技术提供一种有助于恒温扩增体系中生成单链产物的方法；所述单链产物生成方法如下：所述恒温扩增体系包含有两对引物，F1、R1和BF、BR，在某些条件下，F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶区域。本发明专利技术反应速率快、成本低、操作简便，能够通过恒温扩增方法生成单链DNA扩增产物，克服背景技术中存在的技术缺陷。

【技术实现步骤摘要】
一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法
本专利技术属于核酸分析与检测领域，具体涉及一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法。
技术介绍
核酸扩增技术在当今的分析检测领域具有十分重要的意义。食品安全检测、环境监控、医疗诊断、法医鉴定等领域无不依赖于核酸扩增技术。最早也是最经典的核酸扩增技术是在耐热性聚合酶的帮助下，依靠温度的不断循环交替而实现模板变性、引物退火及延伸从而实现目标产物的大量积累，这种技术被称作聚合酶链式反应（PCR）。然而，PCR最大的缺陷也就在于，其不断的温度变化过程对仪器（PCR仪）提出了相对高的要求，并进而限制了其扩增速率。恒温扩增的出现彻底摆脱了对精密温控设备的依赖，仅仅一个热块、一台水浴锅甚至一只保温效果良好的保温瓶、热水瓶等即可满足反应需求。常见的恒温扩增技术包括：环介导等温扩增（LAMP）、重组聚合酶扩增（RPA）、链置换扩增（SDA）、依赖解旋酶的扩增（HDA）等等。然而，这些扩增方法反应时间相对较长，或需要多种酶同时工作而造成检测成本高，或需要特定的核苷酸参与而造成高成本、低反应速率等问题。因此，十分需要一种反应速率快、成本低、操作简便的恒温扩增方法。核酸扩增的另外一个问题在于产物的快速特异性检测。基于凝胶电泳的方法虽然能够根据目标产物的分子量大小而对扩增产物进行较为直观的分析。但是其对专用凝胶成像设备的依赖及操作的费时费力使其不利于现场快速检测。基于可视化显色的钙黄绿素法、浊度法虽然操作简便，但无法鉴别非特异性扩增。而实时荧光定量的方法要求反应仪器具有相对精密的光学设备。试纸条检测方法具有操作简便、结果易于读取、特异性强等优点而广受青睐。但是试纸条检测的缺点是针对某个特殊的分析目标必须对引物实现抗原-抗体修饰或者对目标核酸分子进行探针捕获。对于某些反应过程中引物会被切断的反应，针对引物进行抗原抗体修饰显然并不可取，因此更好的方法是实现探针捕获。但是探针捕获的核酸分子往往是单链，对于双链核酸分子，探针捕获显然并不方便。因此，本专利技术的目的是针对恒温扩增体系提供一种单链DNA产物的生成方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种有助于恒温扩增体系中生成单链产物的方法。所述单链产物生成方法如下：1）所述恒温扩增体系包含有两对引物，F1、R1和BF、BR，在某些条件下，F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶区域。2）所述恒温扩增体系需要至少两种酶的参与：其一为具有链取代活性的聚合酶，能够在引物与模板结合之后在引物的3’端加成核苷酸，使得引物的3’不断延伸，并取代原来模板链的互补链。其二为具有能够特异性识别某些特定核苷酸序列位点，并在具有此特异性核苷酸序列位点的双链DNA中的其中一条单链上产生切口的切口酶。3）所述恒温扩增体系至少包含一条核酸阻遏物，能够与所述恒温扩增体系的其中一条产物进行很强的互补配对，防止在核酸阻遏物的上游的带有切口酶位点的引物与所述产物结合后被聚合酶延伸为长的产物链。4）所述单链产物的生成方法其具体原理（图1）为：（ⅰ）在某些反应温度下，引物F1和BF与同一条模板链结合，引物BF在引物F1的上游。（ⅱ）在聚合酶的作用下，引物F1的3’末端被聚合酶延伸。（ⅲ）在相同的反应温度下，引物BF的3’末端被延伸，并取代F1延伸所得的产物S1。（ⅳ）引物R1和BR与产物S1结合，引物BR在引物R1的上游。（ⅴ）在聚合酶的作用下，引物R1的3’末端被聚合酶延伸。（ⅵ）在相同的反应温度下，引物BR的3’末端被延伸，并取代R1延伸所得的产物P1。（ⅶ）在相同的反应条件下，引物F1与产物P1结合，并在聚合酶的作用下延伸引物F1的3’末端，形成双链产物。（ⅷ）切口酶特异性识别双链DNA产物的切口位点，并在双链区的特异性位点的其中一条DNA链上产生一缺口。（ⅸ）在聚合酶的帮助下，具有缺口的DNA链3’末端继续被延伸，并取代原来的切口位点下游的DNA链。当切口酶浓度较低时，生成产物A1。当切口酶浓度相对过量时，生成产物E1。（ⅹ）引物R1的识别区域与产物A1或产物E1结合，并在引物R1的3’末端沿着产物A1或E1进行延伸。同时，核酸阻遏物与A1或E1结合。（xi）当延伸至核酸阻遏物的位置时，聚合酶的链取代作用不足以取代下强碱基互补配对的核酸阻遏物，引物延伸终止。（xii）切口酶特异性切割出短的延伸产物，单链扩增产物生成。14）所述生成的单链DNA产物优选为30-60nt。15）所述恒温核酸扩增的温度可以为35-65°C。16）所述核酸阻遏物的3’端与所述反应的中间产物A1或者E1的5’端的距离优选为15-22nt。17）所述核酸阻遏物的浓度优选为0.05-0.2uM。18）所述核酸阻遏物的长度优选为14-18nt。19）所述核酸阻遏物的组成可以为不带修饰的核苷酸，也可以为带有修饰的核苷酸；可以为肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）或其特殊核苷酸。20）所述核酸阻遏物的GC含量优选为30%-60%。21）所述的核酸阻遏物的3’羟基末端可以进行某些脱羟基修饰，以避免所述核酸阻遏物本身作为引物被延伸，如生物素化、C3-spacer等。本专利技术的有益效果是：本专利技术反应速率快、成本低、操作简便，能够通过恒温扩增方法生成单链DNA扩增产物，克服
技术介绍
中存在的技术缺陷。附图说明图1是恒温扩增体系中利用核酸阻遏物生成单链DNA扩增产物的方法。具体实施例下面结合具体实施例对本专利技术做进一步描述，但具体实施例并不对本专利技术作任何限定。实施例1：以转基因水稻KMD1的CaMV35S为模板56°C生成60nt单链产物的步骤。CaMV35S模板序列：CACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTC。CaMV35S模板的互补序列：GAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTG。反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10UNt.BstNBI，6UBstDNAPolymerase，2.5ulNEBuffer3，5ulThermopolReactionBuffer，300uMdNTP，500nM引物F1和R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，50nM核酸阻遏物。56°C温浴10min。针对CaMV35S双链模板序列设计引物及核酸阻遏物序列如下：F1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTGACGTAAGGGA。R1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTTCAGCGTGTCCT。BF：TCAAAGCAAGTGGATTGATGTG。BR：AGAGACTGGTGAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）设计两对引物，F1、R1和BF、BR，其中F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶作用区域；（2）选取反应酶，包括具有链取代活性的聚合酶和切口酶，所述聚合酶能够在引物与模板结合之后在引物的3'端加成核苷酸，使得引物的3'不断延伸，并取代原来模板链的互补链；所述切口酶能够识别特异性的核苷酸序列，并在含有此序列的上游、中间、或者下游的双链DNA的其中一条链上产生缺口；（3）选取核酸阻遏物，该核酸阻遏物能够与所述恒温扩增体系的一条产物进行互补配对，防止引物与所述产物结合后被聚合酶被过度延伸；（4）所述单链产物的生成方法具体包括以下步骤：（ⅰ）在某些反应温度下，引物F1和BF与同一条模板链结合，引物BF在引物F1的上游，（ⅱ）在聚合酶的作用下，引物F1的3’末端被聚合酶延伸，（ⅲ）在相同的反应温度下，引物BF的3'末端被延伸，并取代F1延伸所得的产物S1，（ⅳ）引物R1和BR与产物S1结合，引物BR在引物R1的上游，（ⅴ）在聚合酶的作用下，引物R1的3’末端被聚合酶延伸，（ⅵ）在相同的反应温度下，引物BR的3'末端被延伸，并取代R1延伸所得的产物P1，（ⅶ）在相同的反应条件下，引物F1与产物P1结合，并在聚合酶的作用下延伸引物的3’末端，（ⅷ）切口酶特异性识别双链DNA产物的切口位点，并在双链区的特异性位点的其中一条DNA链上产生一缺口，（ⅸ）在聚合酶的帮助下，具有缺口的DNA链3'末端继续被延伸，并取代原来的切口位点下游的DNA链，当切口酶浓度较低时，生成产物A1，当切口相对过量时，生成产物E1，（ⅹ）引物R1的识别区域与产物A1或产物E1结合，并在引物R1的3'末端沿着产物A1或E1进行延伸，同时，核酸阻遏物与A1或E1结合，（xi）当延伸至核酸阻遏物的位置时，聚合酶的链取代作用不足以取代下强碱基互补配对的核酸阻遏物，引物延伸终止，（xii）切口酶特异性切割出短的延伸产物，生成单链扩增产物。...

【技术特征摘要】
1.一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）设计两对引物，F1、R1和BF、BR，其中F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶作用区域；（2）选取反应酶，包括具有链取代活性的聚合酶和切口酶，所述聚合酶能够在引物与模板结合之后在引物的3'端加成核苷酸，使得引物的3'不断延伸，并取代原来模板链的互补链；所述切口酶能够识别特异性的核苷酸序列，并在含有此序列的上游、中间、或者下游的双链DNA的其中一条链上产生缺口；（3）选取核酸阻遏物，该核酸阻遏物能够与所述恒温扩增体系的一条产物进行互补配对，防止引物与所述产物结合后被聚合酶被过度延伸；（4）所述单链产物的生成方法具体包括以下步骤：（ⅰ）在某些反应温度下，引物F1和BF与同一条模板链结合，引物BF在引物F1的上游，（ⅱ）在聚合酶的作用下，引物F1的3’末端被聚合酶延伸，（ⅲ）在相同的反应温度下，引物BF的3'末端被延伸，并取代F1延伸所得的产物S1，（ⅳ）引物R1和BR与产物S1结合，引物BR在引物R1的上游，（ⅴ）在聚合酶的作用下，引物R1的3’末端被聚合酶延伸，（ⅵ）在相同的反应温度下，引物BR的3'末端被延伸，并取代R1延伸所得的产物P1，（ⅶ）在相同的反应条件下，引物F1与产物P1结合，并在聚合酶的作用下延伸引物的3’末端，（ⅷ）切口酶特异性识别双链DNA产物的切口位点，并在双链区的特异性位点的其中一条DNA链上产生一缺口，（ⅸ）在聚合酶的帮助下，具有缺口的DNA链3'末端继续被延伸，并取代原来的切口位点下游的DNA链，当切口酶浓度较低时，生成产物A1，当切口相对过量时，生成产物E1，（ⅹ）引物R1的识...

【专利技术属性】
技术研发人员：王柳，吴坚，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33