新型选择性标记基因制造技术

本发明专利技术涉及新型选择性标记基因，具体涉及在本文称作DSM‑2的新基因。这种基因是在天蓝色链霉菌A3中鉴定的。DSM‑2蛋白与PAT和BAR的关系较远。主题的发明专利技术还提供按植物优化的编码DSM‑2蛋白的基因。DSM‑2可以用作转基因性状以在植物和植物细胞中赋予对除草剂草铵膦和双丙氨酰膦的耐受。主题的基因的一种优选用途是作为选择性标记。在细菌系统中使用这种基因作为选择性标记能够增加植物转化的效率。使用DSM‑2作为单一的选择标记消除了在克隆过程中对额外的药用抗生素标记(例如氨苄青霉素抗性)的需求。按照主题的发明专利技术还可以有多种其它用途。

Novel selectable marker gene

The present invention relates to novel selective marker genes, in particular to a new gene called DSM in this paper 2. The gene was identified in Streptomyces A3. DSM 2 protein and PAT and BAR far away. The theme of the invention also provides according to plant optimized encoding DSM protein gene 2. DSM 2 can be used as to confer transgenic traits in plants and plant cells to the herbicide glufosinate and bialaphos tolerance. A preferred use of the subject gene is as a selective marker. Using this gene as a selectable marker in bacterial systems increases the efficiency of plant transformation. The use of DSM 2 as selection marker single elimination in the cloning process of medicinal antibiotic additional markers (e.g. ampicillin resistance) demand. Depending on the subject, there are many other uses.

【技术实现步骤摘要】
新型选择性标记基因本申请是2007年12月7日提交的申请号为200780051075.0(国际申请号PCT/US2007/086813)、专利技术名称为“新型选择性标记基因”的专利技术专利申请的分案申请。专利技术背景选择性标记是一种可以检测的遗传性状或能够被鉴定和追踪的DNA区段(segment)。标记基因通常充当另一基因(有时称为靶基因)的标志(flag)。标记基因通常与用于转化靶细胞的靶基因一起使用。以可遗传的方式接纳靶基因的靶细胞能够通过选择也表达标记基因的细胞来鉴定。标记基因与靶基因足够接近，因而所述两个基因(标记基因和靶基因)在遗传上连锁并且通常一起遗传。目前选择性标记的标准是“pat”基因，其编码称为膦丝菌素乙酰转移酶的酶。谷氨酰胺合成酶(“GS”)在许多植物中是植物细胞发育和生活的关键酶。GS将谷氨酸转化成谷氨酰胺。GS还参与氨同化和氮代谢。GS参与了在大多数植物中用于解毒由硝酸还原释放的氨的途径中。因此，GS的强力抑制剂对于植物细胞的毒性非常大。分解或修饰植物内的除草剂能够导致抗性。基于植物中因抑制GS而产生的毒性作用，开发了一类特殊的除草剂。双丙氨酰膦(Bialaphos)和膦丝菌素是两个这样的作用于GS的抑制剂并且拥有出色的除草性质。这两种除草剂是非选择性的；它们抑制土壤上存在的全部不同种类植物的生长，因此引起对它们的整体破坏。双丙氨酰膦也是一种广谱除草剂。双丙氨酰膦由膦丝菌素(PPT或PTC；2-氨基-4-甲基膦基丁酸)、L-谷氨酸类似物和两个L-丙氨酸残基组成。因此PPT和双丙氨酰膦之间的结构差异在于PPT缺少两个丙氨酸氨基酸。通过胞内肽酶将双丙氨酰膦的L-丙氨酸残基去除的情况下，则释放PPT。PPT是GS的有利抑制剂。在植物中通过PPT对GS的抑制引起氨的迅速积累和植物细胞的死亡。双丙氨酰膦最初被披露具有抗生素特性，这使得它能够用作杀虫剂或杀真菌剂。美国专利第3,832,394号涉及培养吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)，和从它的培养基回收双丙氨酰膦。然而，其它菌株，例如绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)，也产生这种化合物。其它含有PPT模块(moiety)的三肽抗生素也已知存在于自然界中，例如磷丙氨菌素(phosalacin)。PPT也是通过化学合成获得的并且进行商业销售。产双丙氨酰膦的吸水链霉菌和绿色产生链霉菌受到具有膦丝菌素乙酰转移酶活性的酶的保护而不受PPT毒性影响。PlantPhysiol,April2001,Vol.125,pp.1585-1590(“ExpressionofbarinthePlastidGenomeConfersHerbicideResistance,”Lutz等)。产生这些抗生素的链霉菌属菌种(Streptomycesspecies)本身会受到破坏，如果它们不具有针对这些抗生素的自我防御机制。已经发现这种自我防御机制在多种情况下包含能够抑制抗生素作用的酶。膦丝菌素乙酰转移酶由bar(双丙氨酰膦抗性；Thompson等，1987)或pat(膦丝菌素乙酰转移酶；Strauch等，1988)基因编码，并且通过乙酰化PPT的游离氨基来解毒PPT。由这两种基因编码的酶功能上相同并且在氨基酸水平显示85％同一性(Wohlleben等，1988；Wehrmann等，1996)。已经通过自核基因在胞质中表达嵌合的bar或pat基因获得了PPT抗性作物。已经通过在烟草(烟草栽培种PetitHavana(NicotianatabacumcvPetitHavana))、马铃薯、欧洲油菜(Brassicanapus)、甘蓝(Brassicaoleracea)(DeBlock等，1987；DeBlock等，1989)、玉米(Spencer等，1990)和稻(Cao等，1992)中直接选择PPT抗性获得了除草剂抗性品系。在天蓝色链霉菌A3(StreptomycescoelicolorA3)中鉴定了与hrdDσ因子基因相邻的一个基因(bar)。预测的bar产物与产生双丙氨酰膦的绿色产色链霉菌和吸水链霉菌的pat和bar基因的产物分别显示了32.2％和30.4％的同一性。当处于高拷贝数载体上克隆入天蓝色链霉菌中时，天蓝色链霉菌bar基因赋予对双丙氨酰膦的抗性。Bedford等，Gene,1991Jul31；104(1):39-45,“CharacterizationofageneconferringbialaphosresistanceinStreptomycescoelicolorA3(2).”。在其它微生物中异源表达这种基因，或将这种基因转化入植物，迄今为止尚无报导。除草剂抗性性状的用途参见DE3642829A和美国专利第5,879,903号(以及5,637,489；5,276,268；和5,273,894)，其中pat基因分离自绿色产色链霉菌。WO87/05629和美国专利第5,648,477号(以及5,646,024和5,561,236)涉及使用来自吸水链霉菌的bar基因用于保护植物细胞和植物免于谷氨酰胺合成酶抑制剂(例如PPT)的用途和植物中除草剂抗性的开发。将编码对除草剂BASTA(Hoechst膦丝菌素)或Herbiace(MeijiSeika双丙氨酰膦)的抗性的基因通过农杆菌感染导入烟草(烟草栽培种PetitHavanSR1)、马铃薯(马铃薯栽培种Benolima(SolanumtuberosumcvBenolima))和番茄(番茄(Lycopersicumesculentum))植物中，并且赋予了除草剂抗性。
技术实现思路
主题的专利技术涉及在此称为DSM-2的新基因。这种基因是在天蓝色链霉菌(A3)中鉴定的。DSM-2蛋白与PAT和BAR的关系较远。主题的专利技术还提供按植物优化的编码DSM-2蛋白的基因。DSM-2可以用作转基因性状以在微生物、植物细胞和植物中赋予对除草分子和抗菌分子、草铵膦(glufosinate)、膦丝菌素和/或双丙氨酰膦的耐受。转化入拟南芥(Arabidopsis)允许以高比例回收草铵膦。一旦导入，DSM-2基因能够提供有效的选择(significantselection)和整株植物抗性。主题的基因仅作为用于生物技术工程的选择性标记就具有高固有价值。在一些优选的实施方案中，主题的基因可以用作标记用于选择培养物中成功转化的细胞，和温室及田地中成功转化的整株植物。这种基因和相似的同源物可以代替pat和/或bar使用。在细菌转化系统中使用这种基因作为选择性标记能够增加对所有植物的转化的效率。使用DSM-2作为单一的选择标记消除了克隆过程中对额外的药用抗生素标记(例如氨苄青霉素抗性)的需求。根据主题的专利技术还可能有多种其它用途。DSM-2可用作转基因性状以赋予植物对除草剂草铵膦和双丙氨酰膦的耐受。这种基因也可以连同经修饰的农杆菌属菌株(Agrobacteriumstrain)用作一种新型植物转化系统的基础。用于蛋白质产生并且纳入了非药用抗生素抗性标记基因的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的新菌株或其它的微生物菌株也可以按照主题的专利技术产生。通过免去片段纯化远本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因植物细胞，其包含编码具有膦丝菌素乙酰转移酶活性的蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2，且其中该转基因植物细胞不指植物品种。

【技术特征摘要】
2006.12.07 US 60/873,6021.一种转基因植物细胞，其包含编码具有膦丝菌素乙酰转移酶活性的蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQIDNO:2，且其中该转基因植物细胞不指植物品种。2.权利要求1的细胞，其中所述多核苷酸由选自下组的序列组成：SEQIDNO:1和SEQIDNO:3。3.存在于植物时的权利要求1的植物细胞，其中的植物细胞不指植物品种。4.权利要求1的植物细胞，其中所述细胞进一步包含昆虫抗性基因，所述基因源自选自下组的生物：苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、光杆状菌属(Photorhabdus)和致病杆菌属(Xenorhabdus)。5.权利要求1的植物细胞，其中所述细胞进一步包含第二除草剂抗性基因。6.权利要求3的植物细胞，其中所述植物细胞产生所述蛋白质。7.权利要求6的植物细胞，其中所述蛋白质包含SEQIDNO:2。8.权利要求1的转基因植物细胞，其中所述细胞进一步包含选自下组的除草剂抗性基因：AAD-1和AAD-12。9.权利要求3的植物细胞，其中所述植物细胞进一步包含昆虫抗性基因，该基因源自选自下组的生物：苏云金芽孢杆菌、光杆状菌属和致病杆菌属。10.权利要求3的植物细胞，其中所述植物细胞进一步包含选自下组的农艺性状：真菌抗性、应激耐受、增加的产率、改进的油分布谱(profile)、改进的纤维质量、病毒抗性、延迟的成熟、冷耐受、和盐耐受。11.权利要求6的植物细胞，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾斯廷·M·利拉，特里·R·赖特，肖恩·M·拉塞尔，唐纳德·J·默洛，史蒂文·R·韦伯，妮科尔·L·阿诺德，安德鲁·E·鲁宾逊，凯利·A·史密斯，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国,US