多拷贝基因在霉菌中的定点整合方法技术

提出一种在霉菌中定点整合一个基因多拷贝的方法，其中包括用一段包含至少是编码目的蛋白的一个结构基因的至少一个表达性基因的多个拷贝的ＤＮＡ片段转化一种霉菌细胞，该霉菌细胞的染色体ＤＮＡ中含有稀有切点的内切酶限制性切点，如Ｉ－ＳｃｅＩ，优选导入到预期位点，如在选择性标记基因内部或与之相邻，转化所用的ＤＮＡ片段位于两段与所述限制性位点的上下游及相邻序列同源的片段之间，在转化过程中使用稀有切点的内切酶，然后选择或筛选霉菌染色体ＤＮＡ中插入所述表达性多基因拷贝的霉菌细胞。所述ＤＮＡ片段还包含第三段ＤＮＡ，该ＤＮＡ能够使染色体上破裂或部分缺失的选择性标记基因完整。优选的霉菌包括曲霉属，尤其是泡盛曲霉。还提出一种通过本发明专利技术方法获得的转化霉菌及培养该转化霉菌的方法，生产和可选可不选地分泌目的蛋白的方法，该方法是在一定条件下培养转化霉菌使编码目的蛋白的基因表达，以及可选可不选地分离或浓缩目的蛋白的方法。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种在霉菌中定点整合基因多拷贝的方法，该方法包括：（ｉ）提供一种霉菌细胞，其中在其染色体ＤＮＡ中含有稀有内切酶的限制性位点，（ｉｉ）用一种ＤＮＡ转化该霉菌细胞，所说ＤＮＡ按照５’到３’方向顺序含：（ａ）第一段ＤＮＡ片段，与霉菌染 色体ＤＮＡ中所含的稀有切点的内切酶限制性位点的上游部分和相邻的ＤＮＡ同源，（ｂ）至少一个表达性基因的多拷贝，其中含有编码目的蛋白的结构基因，（ｃ）第二段ＤＮＡ片段，与霉菌染色体ＤＮＡ中所含的稀有切点的内切酶限制性位点的下游部分和相邻 的ＤＮＡ同源，在霉菌转化过程中，提供了稀有切点的内切酶，（ｉｉｉ）筛选或检出所说表达基因多拷贝被插入到霉菌染色体ＤＮＡ中的霉菌细胞。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MJA德格鲁特，AGM贝杰斯伯根，W穆斯特斯，
申请(专利权)人：尤尼利弗公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]