一种应用于防治鳗鲡病害的七星子新型单克隆抗体及其制备制造技术

本发明专利技术公开了一种应用于防治鳗鲡病害的七星子新型单克隆抗体及其制备。该抗体是由鳗鲡IgG抗体免疫七星子获得免疫七星子淋巴细胞，再与SP2/O骨髓瘤细胞进行细胞融合，所得杂交瘤细胞腹腔接种BALB/C小鼠制备得到。该抗体对爱德华氏菌具有显著的杀菌作用，首次将其应用于鳗鲡的爱德华氏菌感染的疾病的预防和治疗。而且在本发明专利技术的方案中，可变淋巴细胞受体(VLR)与IgG相比有更好的抗原识别灵敏性及更高的亲和力，特异性及灵敏度更强；VLR理化性质稳定性优于抗体分子，使其更容易保存；VLR能够突破因哺乳动物免疫耐受而不能产生Ig的限制，可以识别更广泛的抗原表位，在鳗鲡爱德华氏菌病的防治方面具有很好的应用前景。

A novel monoclonal antibody against seven star disease and its preparation for controlling eel diseases

The invention discloses a seven star new monoclonal antibody used for preventing eel diseases and the preparation thereof. The antibody was obtained by immunization with the IgG antibody of the eel BALB/C, and the lymphocyte was fused with SP2/O myeloma cells, and the hybridoma cells were inoculated intraperitoneally. The antibody has a remarkable bactericidal effect on Edward's bacteria. It was first used in the prevention and treatment of Edward's infection in eels. But in the scheme of the invention, the variable lymphocyte receptor (VLR) antigen recognition sensitivity better and higher affinity compared with IgG, the specificity and sensitivity of VLR stronger; physicochemical stability is better than the antibody molecules, making it easier to save; VLR can break through breast-feeding for animal immune tolerance and can not produce Ig limit, can identify the broader epitope, and has good application prospects in the prevention of eel Edwardsiellosis.

【技术实现步骤摘要】
一种应用于防治鳗鲡病害的七星子新型单克隆抗体及其制备
本专利技术属于生物医药
更具体地，涉及一种应用于防治鳗鲡病害的七星子新型单克隆抗体及其制备。
技术介绍
鳗鲡养殖在我国已有20多年的历史，特别是近十多年来，发展更加迅速，现已成为世界第一养鳗大国，鳗鲡是中国输出农产品中赚取外汇最多的一项。鳗鲡养殖发展迅速，与之相比，鳗鲡病害防治技术严重滞后，鳗鲡养殖密度大，单位养殖面积的产值高，受病害的威胁比目前其他水产养殖品种都严重得多，一旦发病，往往给养殖者造成巨大的经济损失。鳗鲡疾病按病原可分为细菌性、寄生虫性、真菌性、病毒性及其他类型病原五大类，其中鳗鲡细菌性疾病为危害最严重的疾病。为了促进包括鳗鲡在内的水产业健康发展，必须加快鱼类基础免疫学的研究，促进鱼类病原学、诊断技术和疫苗学的发展，将免疫预防手段引入到水产养殖业。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上说现有技术的缺陷和不足，开展了鳗鲡新型单克隆抗体的制备研究，将免疫学运用于鳗鲡病原诊断和流行病学研究。本专利技术的目的是提供一种鳗鲡新型单克隆抗体。本专利技术另一目的是提供上说鳗鲡新型单克隆抗体的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：首先，本专利技术提供了一种七星子可变淋巴细胞受体，即鼠抗VLR，以七星子血液淋巴细胞cDNA为模板，利用引物F和引物R克隆出VLR目的基因片段，然后通过原核表达体系表达出目的蛋白VLR，然后免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾淋巴细胞与SP2/0细胞通过细胞融合，筛选得到针对VLR的单克隆抗体杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔得到单抗腹水，纯化获得七星子可变淋巴细胞受体；其中，引物F和引物R和序列分别如SEQIDNO.1和2所示；。具体地，是以七星子血液淋巴细胞cDNA为模板，利用引物F和引物R，克隆出VLR目的基因片段，然后连接载体，转入大肠杆菌中诱导表达出目的蛋白VLR，表达菌破碎后纯化目的蛋白VLR，然后免疫BALB/c小鼠，三次免疫后采血，提取纯化，获得七星子可变淋巴细胞受体，即鼠抗VLR。本专利技术所制备的可变淋巴细胞受体(VLR)与IgG相比有其更好的抗原识别灵敏性及更高的亲和力，VLR理化性质稳定性优于抗体分子，使其更容易保存。七星鱼与哺乳动物亲缘关系较远，VLR能够突破因哺乳动物免疫耐受而不能产生Ig的限制，可以识别更广泛的抗原表位，在免疫性疾病的治疗上具有潜在的药用价值。VLR在识别并特异性结合抗原方面比已有抗体具有更强的特异性及灵敏度。因此，所述七星子可变淋巴细胞受体在制备用于防治鳗鲡病害的七星子VLR新型单克隆抗体中的应用，也在本专利技术的保护范围之内。具体地，所述鳗鲡病害是指鳗鲡爱德华氏菌病。另外，本专利技术提供了一种用于防治鳗鲡病害的VLR新型单克隆抗体，是由鳗鲡IgG抗体免疫七星子获得获得免疫七星子淋巴细胞，再将免疫七星子淋巴细胞与SP2/O骨髓瘤细胞进行细胞融合，利用权利要求1所述七星子可变淋巴细胞受体筛选所得杂交瘤细胞腹腔接种BALB/C小鼠制备得到。具体地，所述鳗鲡单克隆抗体是由如下方法制备得到：S1.制备七星子可变淋巴细胞受体：以七星子血液淋巴细胞cDNA为模板，利用引物F和引物R克隆出VLR目的基因片段，然后通过原核表达体系表达出目的蛋白VLR，然后免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾淋巴细胞与SP2/0细胞通过细胞融合，间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选得到针对VLR的单克隆抗体杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔得到大量的单抗腹水，经ProteinG亲和纯化后的单抗再进行ELISA与Westernblotting检测无误后；最终获得七星子可变淋巴细胞受体，即鼠抗VLR；其中，引物F和引物R和序列分别如SEQIDNO.1和2所示；引物F(SEQIDNO.1)：GTTCGTGCTCAGGGACAGAA；引物R(SEQIDNO.2)：TGCTAAGCTGGGTCAGGTTG；S2.制备鳗鲡IgG抗体；S3.鳗鲡IgG抗体免疫七星子获得免疫七星子淋巴细胞；S4.制备鳗鲡单克隆抗体：将免疫七星子淋巴细胞与SP2/O骨髓瘤细胞进行细胞融合获得杂交瘤细胞，利用鼠抗VLR筛选，再经过有限稀释法克隆制备单克隆细胞，扩大培养，取对数生长期细胞腹腔接种BALB/C小鼠，收集腹水上清，制备获得鳗鲡单克隆抗体。更具体优选地，所述鳗鲡单克隆抗体是由如下方法制备得到：S1.制备鳗鲡IgG抗体：鳗鲡经爱德华氏菌免疫后，分离血清，采用CNBr-activatedSepharose纯化柱进行纯化获得IgG抗体；S2.制备七星子可变淋巴细胞受体：以七星子血液淋巴细胞cDNA为模板，利用引物F：GTTCGTGCTCGGGACAGAA和引物R：TGCTAAGCTGGGCAGGTTG，克隆出目基因片段，然后连接载体，转入大肠杆菌中诱导表达出目的蛋白，表达菌破碎后纯化目的蛋白，然后免疫BALB/c小鼠，三次免疫后采血，提取纯化，获得七星子可变淋巴细胞受体；S3.鳗鲡IgG免疫七星子：鳗鲡IgG首次免疫剂量为100微克，与等量弗氏完全佐剂充分乳化后腹腔注射七星子，第二次以后抗原剂量减半与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射七星子，3～4次免疫后采血，分离提取获得免疫七星子淋巴细胞；S4.制备鳗鲡单克隆抗体：在无菌条件将免疫七星子淋巴细胞重悬于DMEM，并与SP2/O骨髓瘤细胞进行细胞融合；检测杂交瘤细胞上清，取抗体阳性细胞经过有限稀释法克隆，制备单克隆细胞，扩大培养，取对数生长期细胞腹腔接种6周龄BALB/C小鼠，10d后采腹水，收集上清。另外，上述鳗鲡单克隆抗体在作为或制备抗鳗鲡爱德华氏菌的药物方面的应用，以及在作为或制备鳗鲡爱德华氏菌病的防治药物方面的应用，均应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种鳗鲡的新型七星子VLR单克隆抗体，该抗体对爱德华氏菌具有显著的杀菌作用，能够用于防治鳗鲡的爱德华氏菌病，且在识别和特异性结合抗原方面具有很高的特异性，灵敏性高。而且，在本专利技术的方案中，可变淋巴细胞受体(VLR)与IgG相比有其更好的抗原识别灵敏性及更高的亲和力，VLR理化性质稳定性优于抗体分子，使其更容易保存。七星鱼与哺乳动物亲缘关系较远，VLR能够突破因哺乳动物免疫耐受而不能产生Ig的限制，可以识别更广泛的抗原表位，在免疫性疾病的治疗上具有潜在的药用价值。VLR在识别并特异性结合抗原方面比已有抗体具有更强的特异性及灵敏度。附图说明图1为对克隆出的目的基因的检测。图2为目的蛋白的检测。图3为鳗鲡IgG免疫七星子后的效价检测。图4为Western-blot分析抗体特性。图5为小鼠腹水中单克隆抗体效价检测。图6为单克隆抗体活性检测。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1制备鳗鲡单克隆抗体1、七星子可变淋巴细胞受体的制备七星子体内不含Ig类分子，但含有一种替代物质——可变淋巴细胞受体，可以识别更广泛的抗原表位，在识别和特异性结合抗原方面比抗体具有更强的特异性及灵敏度。从NCBI数据库中得到其mRNA序列，设计合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种七星子可变淋巴细胞受体，其特征在于，以七星子血液淋巴细胞cDNA为模板，利用引物F和引物R克隆出VLR目的基因片段，通过原核表达体系表达出目的蛋白VLR，然后免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾淋巴细胞与SP2/0细胞通过细胞融合，筛选得到针对VLR的单克隆抗体杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔得到单抗腹水，纯化获得七星子可变淋巴细胞受体；其中，引物F和引物R和序列分别如SEQ ID NO.1和2所示；。

【技术特征摘要】
1.一种七星子可变淋巴细胞受体，其特征在于，以七星子血液淋巴细胞cDNA为模板，利用引物F和引物R克隆出VLR目的基因片段，通过原核表达体系表达出目的蛋白VLR，然后免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾淋巴细胞与SP2/0细胞通过细胞融合，筛选得到针对VLR的单克隆抗体杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔得到单抗腹水，纯化获得七星子可变淋巴细胞受体；其中，引物F和引物R和序列分别如SEQIDNO.1和2所示；。2.权利要求1所述七星子可变淋巴细胞受体在制备用于防治鳗鲡病害的七星子VLR新型单克隆抗体中的应用。3.一种鳗鲡的七星子VLR单克隆抗体，其特征在于，是由鳗鲡IgG抗体免疫七星子获得获得免疫七星子淋巴细胞，再将免疫七星子淋巴细胞与SP2/O骨髓瘤细胞进行细胞融合，利用权利要求1所述七星子可变淋巴细胞受体筛选所得杂交瘤细胞腹腔接种BALB/C小鼠制备得到。4.根据权利要求3所述的鳗鲡单克隆抗体，其特征在于，由如下方法制备得到：S1.制备七星子可变淋巴细胞受体：以七星子血液淋巴细胞cDNA为模板，利用引物F和引物R克隆出VLR目的基因片段，然后通过原核表达体系表达出目的蛋白VLR，然后免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾淋巴细胞与SP2/0细胞通过细胞融合，筛选得到针对VLR的单克隆抗体杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔得到单抗腹水，纯化获得七星子可变淋巴细胞受体，即鼠抗VLR；S2.制备鳗鲡IgG抗体；S3.鳗鲡IgG抗体免疫七星子获得免疫七星子淋巴细胞；S4.制备鳗鲡单克隆抗体：将免疫七星子淋巴细胞与SP2/O骨髓瘤细胞进行细胞融合获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛涛，许婷，张迷迷，
申请(专利权)人：广州徽商农业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44