一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，采用两种混合机制的填料，两步层析及超滤的方式有效地去除了内毒素、大肠杆菌菌体残留蛋白(HCP)、大肠杆菌残留DNA、蛋白质聚集体等一系列杂质，采用最少的步骤，获得最纯的目标样品，节省了工艺控制成本，同时具有稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化工业化生产等特点。经纯化后的蛋白溶液，用高效液相及SDS‑PAGE电泳测得蛋白纯度大于97％；蛋白回收率大于75％；内毒素降低至1EU/mg以下；HCP及大肠杆菌残留DNA均低于5ppm，可作为原材料用于合成临床用葡萄球菌蛋白A免疫吸附剂。

Method for separating and purifying recombinant staphylococcal protein A

The invention discloses a method for purification of recombinant staphylococcal protein A, using two kinds of mixing mechanism of filler, two step chromatography and ultrafiltration method can effectively remove endotoxin, Escherichia coli bacteria residue protein (HCP), Escherichia coli DNA, residual protein aggregates and a series of impurities, using a minimum number of steps, get the purity of target samples, saves the process of cost control, and has the characteristics of good stability, process control indicators clear, suitable for large scale production of chemical industry. The protein solution was purified by HPLC, and SDS PAGE measured electrophoretic purity was up to 97%; the protein recovery rate was more than 75%; endotoxin decreased to 1EU/mg; HCP and Escherichia coli DNA residues were lower than 5ppm, can be used as raw material for the use of staphylococcal protein A immunoadsorption clinical synthesis.

【技术实现步骤摘要】
一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法
：本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法。
技术介绍
：葡萄球菌蛋白A(简称蛋白A或SPA)是一种多肽单链结构的蛋白质，含有5个高度类似的免疫球蛋白Fc段结合区，能特异性地与人体免疫球蛋白(IgG)结合。将SPA偶联到琼脂糖载体上，制备成载体-SPA复合物装入柱子制成葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱，人体血浆通过该层析柱时，血浆中的IgG型致病抗体将被特异性地吸附掉，一些因IgG型抗体质与量的改变而导致的疾病与症状能够得到明显的治疗和缓解。葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱已广泛应用于自身免疫性疾病、器官移植及恶性肿瘤等疾病的治疗，市场前景广阔。由于葡萄球菌蛋白A的用途广泛，市场需求量日益增加。仅从金黄色葡萄球菌中直接提取天然蛋白，不仅无法满足市场需求。因此近年来人们开始转向基因工程的方法来生产重组葡萄球菌蛋白A。目前葡萄球菌蛋白A主要是通过基因工程菌-大肠杆菌进行表达，通过层析技术纯化，最终得到符合要求的产品。由于大肠杆菌的培养液中含有多种蛋白杂质以及核酸、脂类等非蛋白杂质，给下游的纯化带来严峻考验。其中内毒素是影响最大的因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)菌体预处理：将含有葡萄球菌蛋白A的菌体加入到Bis‑tris缓冲液，然后用均质机破碎后离心收集上清液，调节pH至2.0‑4.0，离心收集上清液，然后调节pH至6.5‑7.2，得到蛋白液；2)第一层析柱处理：将步骤1)得到的蛋白液上样至已用平衡液平衡的装有耐盐型阴离子交换填料的层析柱中，继续用平衡液平衡，用冲洗液冲洗，最后用洗脱液洗脱葡萄球菌蛋白A，收集洗脱峰得第一收集液；所述平衡液含10‑30mM Bis‑tris、0.5‑2wt％TritonX‑100、0.1mol/L NaCl，pH6.5‑7.2；所述冲洗液含10‑...

【技术特征摘要】
1.一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)菌体预处理：将含有葡萄球菌蛋白A的菌体加入到Bis-tris缓冲液，然后用均质机破碎后离心收集上清液，调节pH至2.0-4.0，离心收集上清液，然后调节pH至6.5-7.2，得到蛋白液；2)第一层析柱处理：将步骤1)得到的蛋白液上样至已用平衡液平衡的装有耐盐型阴离子交换填料的层析柱中，继续用平衡液平衡，用冲洗液冲洗，最后用洗脱液洗脱葡萄球菌蛋白A，收集洗脱峰得第一收集液；所述平衡液含10-30mMBis-tris、0.5-2wt％TritonX-100、0.1mol/LNaCl，pH6.5-7.2；所述冲洗液含10-30mMBis-tris、0.1mol/LNaCl，pH6.5-7.2；所述洗脱液含10-30mMBis-tris、1mol/LNaCl，pH6.5-7.2；3)超滤置换缓冲液：将步骤2)得到的第一收集液用截流分子量为5KD的超滤膜包超滤置换为pH6.8-7.5，含5-20mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.1-0.3M脯氨酸的缓冲液，由此得到蛋白液；4)第二层析柱处理：将步骤3)得到的蛋白溶液上样至已用平衡液平衡的装有羟基磷灰石层析填料的柱子中，继续用平衡液平衡，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰得第二收集液；所述平衡液含5-20mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.1-0.3M脯氨酸，pH6.8-7.5；所述洗脱液含100mMNa2HPO4-NaH2PO4，pH6.8-7.5；5)超滤置换为保存液：将步骤4)得到的第二收集液用截流分子量为5KD的超滤膜包超滤置换为生理盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海珍，余波光，李乐军，谢江明，陈校园，
申请(专利权)人：广州康盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44