一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，该试剂盒是一种基因在恒定温度下进行荧光扩增和检测的试剂盒。本发明专利技术的荧光恒温扩增反应试剂配合一种双色荧光标记的探针，适合对埃博拉病毒(埃博拉‑扎伊尔型（Ebola‑Zaire，EBOV‑Z）、埃博拉‑苏丹型（Ebola‑Sudan，EBOV‑S）、埃博拉‑本迪布焦型（Ebola‑Bundibugyo，EBOV‑B）、埃博拉‑莱斯顿型（Ebola Reston，EBOV‑R）和埃博拉‑科特迪瓦型（Ebola Coast，EBOV‑C）)进行快速荧光检测。本发明专利技术的恒温扩增体系，真正实现在同一个温度下进行基因扩增反应，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。本发明专利技术的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在30min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。

A fluorescence constant temperature detection kit for rapid detection of Ebola virus

The invention discloses a fluorescence constant temperature detection kit for rapid detection of Ebola virus, which is a kit for fluorescence amplification and detection of a gene at a constant temperature. The invention of the constant temperature fluorescence amplification reaction reagent probe with a double immunofluorescence staining for the Ebola virus, Ebola (Zaire type (Ebola Zaire, EBOV Z), Sultan (Ebola Ebola type Sudan, EBOV S), Ebola Bundibugyo type (Ebola Bundibugyo EBOV B,), Ebola Reston type (Ebola Reston EBOV R,) and the Ebola type (Ebola Ivory Coast Coast, EBOV C)) rapid fluorescence detection. The constant temperature amplification system of the invention can realize the gene amplification reaction at the same temperature, the composition is simpler, the cost is lower, and the use is more convenient. The invention of the constant temperature amplification amplification system for complex template amplification, fast and stable, can complete the reaction within 30min, amplified with high sensitivity and accuracy, not prone to mismatch amplification effect.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒
本专利技术属生物
，涉及一种核酸恒温扩增技术，尤其涉及一种不依赖于高能能量分子的用于检测埃博拉病毒的荧光恒温扩增技术及试剂盒。
技术介绍
埃博拉（Ebolavirus）又译作伊波拉病毒，是一种能引起人类和灵长类动物产生埃博拉出血热的烈性传染病病毒，其引起的埃博拉出血热（EBHF）是当今世界上最致命的病毒性出血热，有很高的死亡率，在50%至90%之间，病毒潜伏期可达2至21天，但通常只有5天至10天。感染者症状包括恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、体外出血、发烧等。埃博拉病毒（EBoV）属丝状病毒科，长度为970nm，呈长丝状体，单股负链RNA病毒，有18959个碱基，分子量为4.17×106。外有包膜，病毒颗粒直径大约80nm，大小100nm×（300～1500）nm，感染能力较强的病毒一般长（665～805）nm左右，有分支形、U形、6形或环形，分支形较常见。目前已鉴定的埃博拉病毒分为五种不同的亚型：埃博拉-扎伊尔型(Ebola-Zaire，EBOV-Z)、埃博拉-苏丹型(Ebola-Sudan，EBOV-S)、埃博拉-本迪布焦型(Ebola-Bundibugyo，EBOV-B)、埃博拉-莱斯顿型(EbolaReston，EBOV-R)和埃博拉-科特迪瓦型(EbolaCoast，EBOV-C)。其中扎伊尔埃博拉病毒和苏丹埃博拉病毒对人类和非人类灵长类动物的致病性和致死率很高；扎伊尔埃博拉病毒可高达90％的致死率。因此，荧光恒温检测埃博拉病毒方法的建立具有重大意义。目前由于埃博拉治疗的特效药物以及相关的预防疫苗还没有上市。所以荧光恒温检测埃博拉具有预防和治疗的积极意义。埃博拉病毒病病人样本具有极端生物危害风险；只有在最高级别的生物防护条件下才可进行检测。常用的诊断方法有：ELISA法和RT-PCR法。ELISA法是一种将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术，其特异性强，因为抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，而两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。但其干扰因素较多（如温度、时间），重复性不好；且容易受到自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性。RT-PCR法为最经典的检测方法：是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形，在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。但缺点在于操作时间长，所需仪器设备昂贵，需要配备专业技术人员在专业的实验室中进行检测，操作复杂，耗时长，无法做到现场即时检测，不适合临床样本的大批量处理及检测。
技术实现思路
针对现行技术重复性差、容易出现假阳性、耗时长、操作复杂、仪器设备昂贵等问题，本专利技术提供了一种不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，仅需在恒温条件下即可进行核酸的扩增的试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，包括RNA提取液，反应液，启动液，反应酶系，埃博拉病毒的特异性引物及探针，内标18SRNA的特异性引物及探针，阴阳性质控品，其特征在于：所述的特异性引物及探针序列如下：检测扎伊尔埃博拉病毒的上游引物的序列为：GGTGAGCATGCCACAGTTAGAGGGAGTAGCTT（SEQIDNO：1）；下游引物的序列为：CATAGCAACGGTTACAATATTCTATAAAAGGT（SEQIDNO：2）；荧光探针序列为：FAM-TAAC(dSpacer)GATTTAGAGAAATACAATCTTGCATTTA-BHQ（SEQIDNO：3）；检测苏丹埃博拉病毒的上游引物序列为：CTCTATGACAGGCTGGCTTCAACTGTAATTTAC（SEQIDNO：4）；下游引物的序列为：AGTTTACTGCCTCTCGAATGGGGGGTGACTGAA（SEQIDNO：5）；荧光探针序列为：FAM-CTGA(dSpacer)GGGGTAATTGCATTCTTGATATTGGCT-BHQ（SEQIDNO：6）；检测本迪布焦埃博拉病毒的上游引物的序列为：ACAGGCAAGATTCCGATTACCGATATCTTCAA（SEQIDNO：7）；下游引物的序列为：GGTCTGGACACTGCGTGTTTGAACACTTGG（SEQIDNO：8）；荧光探针序列为：FAM-GAAA(dSpacer)TTGAAACCTTACCTAGTATAAGTCCCT-BHQ（SEQIDNO：9）；检测莱斯顿埃博拉病毒的上游引物的序列为：TTTCTTGATTTGAACATAGTCATAAGGGGATAAAT（SEQIDNO：10）；下游引物的序列为：GATCACATTTTCAATGGGCGAAGCATTTTAAGCA（SEQIDNO：11）；荧光探针序列为：FAM-TACT(dSpacer)TATATTTCTGATTGTGGATTGACCCAT-BHQ（SEQIDNO：12）；检测科特迪瓦埃博拉病毒的上游引物的序列为：AACCCTTTCAAGTGAAGAGTTGTCTTTCGTACC（SEQIDNO：13）；下游引物的序列为：GGTTGTGGGCGGAGATGGGAGGAGAGACCGTCG（SEQIDNO：14）；荧光探针序列为：FAM-CCAG(dSpacer)AACCCAGAACCAGGTCCTTGACACGA-BHQ（SEQIDNO：15）；检测内标18SRNA的上游引物的序列为：GTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACTCT（SEQIDNO：16）；下游引物的序列为：GCATCACAGACCTGTTATTGCTCAATCTCGG（SEQIDNO：17）；荧光探针序列为：VIC-CATG(dSpacer)TAACTAGTTACGCGACCCCCGAGCGGTC-BHQ（SEQIDNO：18）。一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其RNA提取液的组分包括：德国QIAGENRNA提取试剂盒(Qia-14162)一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其反应液的组分包括：Tris-缓冲液35~65mMKCl45~75mM(NH4)2SO45~25mMTritonX-1000.06%~0.8%DTT8~18mMPEG3%~6%BSA0.06~0.8mg/mL优选的，Tris-缓冲液可选自Tris-H2SO4、Tris-乙酸、Tris-HCl中的任意一种或多种，Tris-缓冲液的pH为7.0～9.0。一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其启动液的组分包括：Mg2+5mM~20mM优选的，Mg2+来自于硫酸镁、乙酸镁、氯化镁中的任意一种或多种。一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其反应酶系的组分包括：dNTPs150~350uM聚合酶Bsu50~200ng/ul单链结合蛋白200~400ng/ul重组酶（E.coliRecT）300~500ng/ul逆转录酶0.2~1U/ul聚合酶、单链结合蛋白、重组酶和逆转录酶的用量可以根据需要调整其添加量，或通过预实验确定其用量。优选的，一种快速检测埃博拉病毒的荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，包括RNA提取液，反应液，启动液，反应酶系，埃博拉病毒的特异性引物及探针，内标18S RNA的特异性引物及探针，阴阳性质控品，其特征在于：所述埃博拉病毒的特异性引物及探针序列如下：检测扎伊尔埃博拉病毒的上游引物的序列为：GGTGAGCATGCCACAGTTAGAGGGAGTAGCTT（SEQ ID NO：1）；下游引物的序列为：CATAGCAACGGTTACAATATTCTATAAAAGGT（SEQ ID NO：2）；荧光探针序列为：FAM‑TAAC(dSpacer)GATTTAGAGAAATACAATCTTGCATTTA‑BHQ（SEQ ID NO：3）；检测苏丹埃博拉病毒的上游引物序列为：CTCTATGACAGGCTGGCTTCAACTGTAATTTAC（SEQ ID NO：4）；下游引物的序列为：AGTTTACTGCCTCTCGAATGGGGGGTGACTGAA（SEQ ID NO：5）；荧光探针序列为：FAM‑CTGA(dSpacer)GGGGTAATTGCATTCTTGATATTGGCT‑BHQ（SEQ ID NO：6）；检测本迪布焦埃博拉病毒的上游引物的序列为：ACAGGCAAGATTCCGATTACCGATATCTTCAA（SEQ ID NO：7）；下游引物的序列为：GGTCTGGACACTGCGTGTTTGAACACTTGG（SEQ ID NO：8）；荧光探针序列为：FAM‑GAAA(dSpacer)TTGAAACCTTACCTAGTATAAGTCCCT‑BHQ（SEQ ID NO：9）；检测莱斯顿埃博拉病毒的上游引物的序列为：TTTCTTGATTTGAACATAGTCATAAGGGGATAAAT（SEQ ID NO：10）；下游引物的序列为：GATCACATTTTCAATGGGCGAAGCATTTTAAGCA（SEQ ID NO：11）；荧光探针序列为：FAM‑TACT(dSpacer)TATATTTCTGATTGTGGATTGACCCAT‑BHQ（SEQ ID NO：12）；检测科特迪瓦埃博拉病毒的上游引物的序列为：AACCCTTTCAAGTGAAGAGTTGTCTTTCGTACC（SEQ ID NO：13）；下游引物的序列为：GGTTGTGGGCGGAGATGGGAGGAGAGACCGTCG（SEQ ID NO：14）；荧光探针序列为：FAM‑CCAG(dSpacer)AACCCAGAACCAGGTCCTTGACACGA‑BHQ（SEQ ID NO：15）；所述内标18S RNA的特异性引物及探针序列如下：检测内标18S RNA的上游引物的序列为：GTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACTCT（SEQ ID NO：16）；下游引物的序列为：GCATCACAGACCTGTTATTGCTCAATCTCGG（SEQ ID NO：17）；荧光探针序列为：VIC‑CATG(dSpacer)TAACTAGTTACGCGACCCCCGAGCGGTC‑BHQ（SEQ ID NO：18）。...

【技术特征摘要】
1.一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，包括RNA提取液，反应液，启动液，反应酶系，埃博拉病毒的特异性引物及探针，内标18SRNA的特异性引物及探针，阴阳性质控品，其特征在于：所述埃博拉病毒的特异性引物及探针序列如下：检测扎伊尔埃博拉病毒的上游引物的序列为：GGTGAGCATGCCACAGTTAGAGGGAGTAGCTT（SEQIDNO：1）；下游引物的序列为：CATAGCAACGGTTACAATATTCTATAAAAGGT（SEQIDNO：2）；荧光探针序列为：FAM-TAAC(dSpacer)GATTTAGAGAAATACAATCTTGCATTTA-BHQ（SEQIDNO：3）；检测苏丹埃博拉病毒的上游引物序列为：CTCTATGACAGGCTGGCTTCAACTGTAATTTAC（SEQIDNO：4）；下游引物的序列为：AGTTTACTGCCTCTCGAATGGGGGGTGACTGAA（SEQIDNO：5）；荧光探针序列为：FAM-CTGA(dSpacer)GGGGTAATTGCATTCTTGATATTGGCT-BHQ（SEQIDNO：6）；检测本迪布焦埃博拉病毒的上游引物的序列为：ACAGGCAAGATTCCGATTACCGATATCTTCAA（SEQIDNO：7）；下游引物的序列为：GGTCTGGACACTGCGTGTTTGAACACTTGG（SEQIDNO：8）；荧光探针序列为：FAM-GAAA(dSpacer)TTGAAACCTTACCTAGTATAAGTCCCT-BHQ（SEQIDNO：9）；检测莱斯顿埃博拉病毒的上游引物的序列为：TTTCTTGATTTGAACATAGTCATAAGGGGATAAAT（SEQIDNO：10）；下游引物的序列为：GATCACATTTTCAATGGGCGAAGCATTTTAAGCA（SEQIDNO：11）；荧光探针序列为：FAM-TACT(dSpacer)TATATTTCTGATTGTGGATTGACCCAT-BHQ（SEQIDNO：12）；检测科特迪瓦埃博拉病毒的上游引物的序列为：AACCCTTTCAAGTGAAGAGTTGTCTTTCGTACC（SEQIDNO：13）；下游引物的序列为：GGTTGTGGGCGGAGATGGGAGGAGAGACCGTCG（SEQIDNO：14）；荧光探针序列为：FAM-CCAG(dSpacer)AACCCAGAACCAGGTCCTTGACACGA-BHQ（SEQIDNO：15）；所述内标18SRNA的特异性引物及探针序列如下：检测内标18S...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘淑园，陈华云，丁渭，肖湘文，张天海，曾烨，邓金萍，
申请(专利权)人：广州和实生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44