一种核酸扩增的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种核酸扩增的检测方法，在第一PCR管加入反应扩增液，在第二PCR管加入钙黄绿素和MnO2纳米材料，在第三PCR管加入焦磷酸盐溶液；试纸条探针分别放置在第二PCR管和第三PCR管中，或者，在第一PCR管放入抗原修饰的引物；以具有三个接口的可视化核酸扩增检测装置作为盖，将三个PCR管分别密封连到可视化核酸扩增检测装置的三个接口上，反应结束后，将反应扩增液，钙黄绿素，MnO2和焦磷酸盐溶液混合，本发明专利技术通过判断混合液的颜色是否为黄绿色判断混合均匀，然后再进行试纸条检测核酸恒温扩增结果，能在不开盖的情况下监控试纸条检测前样品混匀程度，使采用试纸条检测的结果更加准确。

Nucleic acid amplification detection method

The present invention provides a nucleic acid amplification detection method, in the first PCR pipe with reaction liquid, second PCR pipe with calcein and MnO2 nano materials, in the third PCR tube pyrophosphate solution; strip probes were placed in the second third PCR tube and PCR tube, or, in the first PCR tube primers in antigen modification; nucleic acid has three interfaces in visual amplification detection device as a cover, three PCR were sealed even three interfaces to the visualization of nucleic acid amplification detection device on the tube, after the reaction, the reaction liquid calcium, yellow green, mixed MnO2 and pyrophosphate solution, the invention by determine the mixture color is yellow green and then determine the mixing, amplification of the test strip in nucleic acid temperature, without opening the cover under the condition of monitoring the test strip before mixing samples The result is that the result of test strip test is more accurate.

【技术实现步骤摘要】
一种核酸扩增的检测方法
本专利技术属于核酸分析与检测领域，具体涉及一种核酸扩增产物的可视化检测方法。
技术介绍
核酸扩增技术在当今的分析检测领域具有十分重要的意义。食品安全检测、环境监控、医疗诊断、法医鉴定等领域无不依赖于核酸扩增技术。最早也是最经典的核酸扩增技术是在耐热性聚合酶的作用下，依靠温度的不断循环交替而实现模板变性、引物退火及延伸从而实现目标产物的大量积累，这种技术被称作聚合酶链式反应(PCR)。然而，PCR最大的缺陷也就在于，其不断的温度变化过程对仪器(PCR仪)提出了相对高的要求，并进而限制了其扩增速率。恒温扩增的出现彻底摆脱了对精密温控设备的依赖，仅仅一个热块、一台水浴锅甚至一只保温效果良好的保温瓶、热水瓶等即可满足反应需求。常见的恒温扩增技术包括：环介导等温扩增(LAMP)、重组聚合酶扩增(RPA)、链置换扩增(SDA)、依赖解旋酶的扩增(HDA)、切口酶介导的扩增反应(NEAR)等等。恒温扩增的出现为现场快速检测提供了十分大的便利。然而，一个重要问题仍然限制核酸扩增现场快速检测，即对扩增产物的快速特异性检测。钙黄绿素通常用于核酸恒温扩增产物的可视化检测，但是常用的方法是在核酸扩增液中添加Mn2+猝灭钙黄绿素的荧光。随着核酸扩增的进行，释放大量的焦磷酸盐的时候，焦磷酸盐由于与Mn2+的结合作用更强，从而使钙黄绿素脱离Mn2+，荧光恢复。这种方法除了检测结果不够特异以外，Mn2+的引入也会对扩增本身有较大的抑制作用。同时，对于扩增效率比较低的样本其本身焦磷酸盐产生的量就不多，因而钙黄绿素的荧光恢复不明显。同时由于反应本身产生的焦磷酸盐并不会足够多，所以对钙黄绿素和Mn2+的用量提出了严格的要求。可视化试纸条用于核酸扩增检测具有特异、方便、快速、结果可靠、成本低廉等优点。但是，利用试纸条对核酸扩增结果进行检测通常需要较大体积(通常50-200μL)检测液体，以便扩增分子在试纸条上顺畅而快速的流动。但是在利用试纸条对核酸扩增结果进行检测的过程中，往往有几个方面的因素限制了扩增产物直接用于试纸条检测，必须通过对扩增产物进行稀释后才能用于试纸条检测，如：(1)反应试剂体积的增大往往意味着反应成本骤增；(2)核酸扩增反应试剂中经常含有某些试剂(如PEG，PVA等)导致扩增体系的过于黏稠，影响样品分子在试纸条上的涌动，造成检测结果的不准确；(3)某些通过探针检测的体系必须在反应后加入探针、缓冲溶液；(4)扩增产物量太大，超出所设计纸条的检测范围，造成钩状效应；等等。这些因素的存在都要求试纸条检测过程中必须加入额外的试剂以保证检测结果的准确性。然而在开盖操作的情况下，扩增产物容易形成气溶胶污染，影响后续检测结果的准确性。针对此问题，目前有多种检测装置，专利技术人开发出了一种装置(ZL201520424418.5)，能够在不开盖的情况下实现对扩增产物的稀释。但是，依靠这些装置，稀释过程中样品的混合均匀程度对检测结果仍然有很大的影响，如果样品没有混合均匀将直接影响检测结果的准确性。而如何判断样品是否混合均匀却是一个难题。因此，本专利技术利用钙黄绿素的荧光猝灭效果，结合核酸试纸条的检测特异性，提出了一种利用钙黄绿素检测核酸扩增产物混合均匀程度的方法，进一步保障核酸试纸条检测结果的准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种核酸扩增的检测方法，能在不开盖的情况下监控试纸条检测前样品混匀程度，使采用试纸条检测的结果更加准确。为此，本专利技术采用以下技术方案：一种核酸扩增的检测方法，其特征在于：在第一PCR管加入反应扩增液，在第二PCR管加入钙黄绿素和MnO2纳米材料，在第三PCR管加入焦磷酸盐溶液；试纸条探针分别放置在第二PCR管和第三PCR管中，或者，在第一PCR管放入抗原修饰的引物；以具有三个接口的可视化核酸扩增检测装置作为盖，将三个PCR管分别密封连到可视化核酸扩增检测装置的三个接口上，可视化核酸扩增检测装置的检测室内预先装好核酸检测试纸条；将密封好的装置放在PCR仪或者金属浴上进行扩增；待扩增反应结束后，在不打开可视化核酸扩增检测装置的情况下，以可视化核酸扩增检测装置为连通器，对可视化核酸扩增检测装置和三个PCR管的连接体进行混匀操作，将反应扩增液，钙黄绿素，MnO2和焦磷酸盐溶液混合，通过判断混合液的颜色是否为黄绿色判断混合均匀，然后再进行试纸条检测核酸恒温扩增结果。由于第一PCR管中的扩增液中加入有二硫苏糖醇DTT，能够还原棕褐色的MnO2,变成Mn2+,使得溶液变成无色，但是第三PCR管中焦磷酸盐的存在螯合生成的Mn2+,使得钙黄绿素荧光恢复，溶液呈现黄绿色。试纸条检测时，水平倒置装置，使混合液流向逐渐流向试纸条，并在试纸条上出现红色线条，指示检测结果。相比于传统的利用钙黄绿素进行核酸扩增产物的检测方法，本专利技术虽然同样可以采用钙黄绿素进行判断，方法却有很大的差异。在本专利技术中，钙黄绿素和MnO2同时置于第二PCR管中，由于MnO2具有很强的荧光猝灭作用，使得在扩增液与检测液混合前仅第二PCR管为棕褐色，第一和第三PCR管溶液为无色。DTT是核酸扩增体系中经常使用的增强剂，也是强的还原剂，在核酸扩增体系中使用的浓度可以高达1-10mM。扩增结束后混匀的过程中，一旦具有氧化性质的MnO2与还原性的DTT相遇即被还原成Mn2+。尽管Mn2+的存在仍然不能使钙黄绿素荧光恢复，但是当我们在第三PCR管中添加过量的焦磷酸盐时，焦磷酸盐能够充分螯合Mn2+，从而使钙黄绿素的荧光充分释放。此外，由于MnO2是一种很好的DNA吸附剂，能够有效而快速的吸附DNA，使得吸附在MnO2表面的探针DNA可以在室温条件下长期稳定保存。并且，当与扩增液混合时，MnO2迅速捕获周围的产物DNA，而当其被还原的过程中，被其捕获到的DNA由于空间距离的接近以及生成的Mn2+屏蔽了DNA之间的静电斥力，从而可以有效地提高探针与产物之间的互补配对速率。相比于已经报道的钙黄绿素法，这种方法并不要求精确控制钙黄绿素的用量，而混合液中过量的焦磷酸盐又能够保证被DTT还原生成的Mn2+能够被完全螯合，充分保证了钙黄绿素的黄绿色荧光的释放，且颜色变成很深的亮黄绿色，极利于肉眼判断，使本专利技术能够在不开盖的情况下检测稀释过程中样品的混合均匀程度，使核酸恒温扩增的检测更容易操作，采用试纸条检测的结果更加准确。所述的钙黄绿素的浓度的范围在混合前优选为：20μM-500μM；更优选为50-200μM。所述二氧化锰浓度在混合前优选为50μg/mL-200μg/mL,更优选为100μg/mL-150μg/mL。所述焦磷酸盐浓度在混合前优选为500μM-50mM,更优选为1mM-10mM。所述试剂的浓度范围优选主要原因在于，钙黄绿素的浓度在高于20μM时具有明显的肉眼易于识别的黄绿色，低于此浓度，如10μM，尽管也能肉眼可见，但是通常需要在白色的背景下才易于观察。而钙黄绿素浓度过高时，如超过500μM，其浓度靠近棕红色，与MnO2的棕褐色十分类似，此时很难判断MnO2是否被溶解成Mn2+,因此钙黄绿素的浓度范围优选为20μM-500μM。尤其在50μM-200μM之间,钙黄绿素呈现明显且纯正的黄绿色，因此，此范围为钙黄绿素的最佳浓度。二氧化锰的优选浓度必须满足能够本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸扩增的检测方法，其特征在于：在第一PCR管加入反应扩增液，在第二PCR管加入钙黄绿素和MnO2纳米材料，在第三PCR管加入焦磷酸盐溶液；试纸条探针分别放置在第二PCR管和第三PCR管中，或者，在第一PCR管放入抗原修饰的引物；以具有三个接口的可视化核酸扩增检测装置作为盖，将三个PCR管分别密封连到可视化核酸扩增检测装置的三个接口上，可视化核酸扩增检测装置的检测室内预先装好核酸检测试纸条；将密封好的装置放在PCR仪或者金属浴上进行扩增；待扩增反应结束后，在不打开可视化核酸扩增检测装置的情况下，以可视化核酸扩增检测装置为连通器，对可视化核酸扩增检测装置和三个PCR管的连接体进行混匀操作，将反应扩增液，钙黄绿素，MnO2和焦磷酸盐溶液混合，通过判断混合液的颜色是否为黄绿色判断混合均匀，然后再判断试纸条检测核酸恒温扩增结果。

【技术特征摘要】
1.一种核酸扩增的检测方法，其特征在于：在第一PCR管加入反应扩增液，在第二PCR管加入钙黄绿素和MnO2纳米材料，在第三PCR管加入焦磷酸盐溶液；试纸条探针分别放置在第二PCR管和第三PCR管中，或者，在第一PCR管放入抗原修饰的引物；以具有三个接口的可视化核酸扩增检测装置作为盖，将三个PCR管分别密封连到可视化核酸扩增检测装置的三个接口上，可视化核酸扩增检测装置...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚，王柳，应义斌，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33