分子检测测定制造技术

本发明专利技术涉及一种分子检测测定，包括在容许细胞破碎和核酸处理的条件下直接用亚硫酸氢盐试剂处理生物样品；从所述经处理的样品中去除所述亚硫酸氢盐试剂；并且检测所述经处理的样品中的靶核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分子检测测定
本专利技术涉及用于处理样品以进行分子检测测定，特别是处理临床样品以进行核酸检测测定以检测疾病的方法。专利技术背景人的分子测试已经对医疗诊断和患者管理变得越来越重要。动物的分子测试在兽医应用中日渐重要。核酸测试是现代法医学、移民、亲子鉴定和其它人身份应用的必需工具。实验胚胎学对癌症研究、鉴定生物标志、素质因素和潜在药物靶标变得越来越重要。RNA基因分型涵盖研究、应用测试和诊断学的所有领域中一系列用于分析个体或细胞之间遗传差异的应用。处理生物样品时，目前的分子测试需要在用例如聚合酶链式反应(PCR)等技术进行核酸检测之前，对样品进行特定预处理。目前认为样品预处理是必需的并且已经开发了许多商业试剂盒和系统并且正用于市场中。不幸的是，预处理增加了分子测试的成本并且需要额外处理时间和设备。人类遗传标记控股有限公司(HumanGeneticSignaturesPtyLtd)(悉尼，澳大利亚)已经开发了如WO2006/058393和US7833942中所公开的用于检测微生物的方法。所述方法包括用一种试剂处理微生物的微生物核酸以形成源自微生物核酸的简化形式的核酸，所述微生物核酸具有可用于检测微生物的独特核酸序列。本专利技术人已经开发了不需要如同分子检测测定中目前所需要的样品预处理的改进的分子检测测定。专利技术概述本专利技术涉及对生物样品进行的分子检测测定，其不需要样品清除步骤或处理生物样品以溶解细胞或纯化核酸。在第一方面，本专利技术提供了一种分子检测测定，包括：(a)在容许细胞破碎和核酸处理的条件下直接用亚硫酸氢盐试剂处理生物样品；(b)从所述经处理的样品中去除所述亚硫酸氢盐试剂；并且(c)检测所述经处理的样品中的靶核酸。在步骤(a)之前，所述生物样品不需要细胞破碎或化学/物理处理。所述生物样品可选自粪便、鼻腔、血液、血浆、血清、口腔细胞、脓液、伤口、浓缩滤液、脑脊髓液、精液、液基细胞学(LBC)、组织、FFPE、激光捕获细胞、培养细胞、沉淀细胞、细菌培养物、细菌菌落、病毒悬液、抽吸物、支气管灌洗、痰液样品、环境样品、环境浓缩物、粮食、原料、水样或水浓缩物等。检测到的核酸可为DNA、RNA或DNA和RNA的组合。所述测定适合于检测动物的传染病、遗传性疾病或遗传特性。优选地，所述动物为人。所述传染病可由微生物引起，所述微生物包括细菌、病毒、类病毒、酵母菌、真菌、朊病毒、寄生虫或变形虫。所述遗传性疾病可为癌症、突变、拷贝数改变、遗传病症、环境诱导的疾病、由暴露于致癌物引起的疾病、特征在于基因组中核苷酸重复长度扩大或减小的疾病。遗传特性可为对癌症或任何其它疾病的易感性，其中遗传和表观遗传变化促成疾病状态的发展。优选地，亚硫酸氢盐试剂为亚硫酸氢钠或偏亚硫酸钠。优选地，以浓度为约2.5M至约3.5M，pH范围为约4.5至约5.5使用亚硫酸氢盐试剂。更优选地，以浓度为约3M，pH为约5.0使用亚硫酸氢盐试剂。优选地，步骤(a)包括在约75℃和95℃之间加热约1分钟至30分钟。更优选地，在约80℃和95℃之间的温度下加热所述样品约10至20分钟。应了解，温度和加热持续时间可根据处理的样品和待检测核酸的细胞来源而改变。可通过任何适合方式从经处理的样品中去除亚硫酸氢盐。实例包括基于柱的纯化或基于珠粒的纯化最佳，但是在一些情况下简单的沉淀步骤可能已足够。去除亚硫酸氢盐之后，优选地使所述样品再悬浮于pH为至少10，更优选介于约pH11.5至约12.5的洗脱缓冲液中。已经发现至少为约12的pH适合大多数样品。亚硫酸氢盐试剂将经处理的核酸中的胞嘧啶修饰为尿嘧啶。在双链DNA中，亚硫酸氢盐试剂将互补双链基因组DNA的每条链中的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，形成除非互补核酸分子外的两种衍生物。在一种优选的形式中，衍生微生物核酸大体上含有碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)并且具有与相应的未经处理的核酸大体上相同的碱基总数。如果扩增经处理的核酸，则扩增的核酸大体上含有碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。可通过任何适合方式例如聚合酶链式反应(PCR)、恒温扩增或信号放大进行扩增。在一种优选的形式中，所述测定进一步包括为经处理的样品提供核酸引物或探针。优选地，经处理的样品经历扩增反应以形成对微生物或遗传指示物特异的靶核酸分子。优选通过扩增检测靶核酸分子。适合的扩增检测的实例包括PCR、qPCR、逆转录酶PCR、数字PCR、恒温扩增或信号放大。也可通过测序法例如Roche454、ABISOLiD或离子激流系统(Iontorrentsystem)、IlluminaHiSeqSBS技术、太平洋生物科学公司(PacificBiosciences)采用的HelicosHeliscope或SMRT技术或任何其它等效技术检测经处理的核酸。在一种优选的形式中，通过以下方式检测靶核酸分子：提供能够与微生物特异性核酸分子的靶区域结合的检测配体并且容许检测配体有足够时间与靶区域结合；并且测量检测配体与靶区域的结合以检测微生物特异性核酸分子的存在。在另一种优选的形式中，通过分离扩增产物并且使分离的产物显现来检测靶核酸分子。优选地，通过电泳分离扩增产物并且通过使凝胶上的一条或多条带显现检测扩增产物。优选地，靶核酸分子不会自然存在于细胞中。第二方面，本专利技术提供了用于分子检测测定以直接处理样品的试剂盒，所述试剂盒包含：亚硫酸氢盐试剂；核酸洗脱和反应试剂；所述靶核酸的PCR引物；和进行所述测定的说明书。试剂盒可进一步包括核酸分离或纯化柱、PCR混合液(mastermix)、PCR试剂、对照核酸引物、反应管、试管、拭子等。整篇说明书中，除非上下文另外要求，词“包含(comprise)”或其变型例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解为暗示包括陈述的元素、整数或步骤或一组元素、整数或步骤，但不排除任何其它元素、整数或步骤或一组元素、整数或步骤。对已经包括在本说明书内的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是为了对本专利技术提供上下文关系的目的。不得将其视为承认任何或全部这些问题形成了现有技术基础的组成部分或是本专利技术相关领域中的一般常识，因为在开发本专利技术之前其在澳大利亚存在。为了可能更清楚地理解本专利技术，将参考下列附图和实施例描述优选的实施方案。附图简述图1示出了使用本专利技术检测艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)的结果。A.Fam通道对艰难梭状芽孢杆菌的tcdA/B基因有特异性；B.Cy5通道对提取对照有特异性。图2示出了来自相同样品的3种病毒的扩增结果。A.Fam＝诺如病毒(norovirus)(单链RNA病毒)；B.Hex＝腺病毒(双链DNA病毒)；C.Cy5＝轮状病毒(单链RNA病毒)。图3示出了将人细胞加标(spike)到排泄物中的影响。A.显示在3M亚硫酸氢盐试剂中于95℃下加热人MRC5细胞15分钟，然后再悬浮于高pH缓冲液(12.3)中并且扩增人β-球蛋白基因。B.显示将相同细胞加标到排泄物中，在3M亚硫酸氢盐试剂中于95℃下加热15分钟，然后再悬浮于高pH缓冲液(12.3)中并且扩增人β-球蛋白基因。实施本专利技术的模式优点本专利技术有许多包括以下的优于现有技术方法的优点。a.样品的细胞溶解和核酸转化在相本文档来自技高网...

【技术保护点】
亚硫酸氢盐试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于使用能混悬在液体中的选自以下的生物样品检测动物的传染病、遗传性疾病或遗传特性的分子检测测定：粪便、血液、口腔细胞、脓液、浓缩滤液、脑脊髓液、精液、激光捕获细胞、培养细胞、沉淀细胞、细菌培养物、细菌菌落、病毒悬液、抽吸物、痰液样品、环境样品、环境浓缩物、粮食和原料，其中所述测定在用亚硫酸氢盐处理前无需预处理生物样品而进行，所述亚硫酸氢盐处理是与浓度为3M至3.5M、pH为5.0至5.5的亚硫酸氢盐试剂在温度80℃至95℃加热所述生物样品10至20分钟，除去亚硫酸氢盐，将经处理的样品重悬在pH为12至12.5的缓冲液中，然后利用核酸引物或探针进行PCR扩增。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.亚硫酸氢盐试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于使用能混悬在液体中的选自以下的生物样品检测动物的传染病、遗传性疾病或遗传特性的分子检测测定：粪便、血液、口腔细胞、脓液、浓缩滤液、脑脊髓液、精液、激光捕获细胞、培养细胞、沉淀细胞、细菌培养物、细菌菌落、病毒悬液、抽吸物、痰液样品、环境样品、环境浓缩物、粮食和原料，其中所述测定在用亚硫酸氢盐处理前无需预处理生物样品而进行，所述亚硫酸氢盐处理是与浓度为3M至3.5M、pH为5.0至5.5的亚硫酸氢盐试剂在温度80℃至95℃加热所述生物样品10至20分钟，除去亚硫酸氢盐，将经处理的样品重悬在pH为12至12.5的缓冲液中，然后利用核酸引物或探针进行PCR扩增。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述血液样品是血浆或血清，所述环境样品是水样品，所述环境浓缩物是水浓缩物。3.根据权利要求1所述的用途，其中所述传染病由微生物引起。4.根据权利要求3所述的用途，其中所述微生物为细菌、病毒、类病毒、真菌或寄生虫。5.根据权利要求1所述的用途，其中所述遗传性疾病为癌症、遗传病或环境诱导的疾病。6.根据权利要求1所述的用途，其中所述亚硫酸氢盐试剂为亚硫酸氢钠或偏亚硫酸钠。7.根据权利要求1所述的用途，其中以浓度3M，pH为5.0使用所述亚硫酸氢盐试剂。8.一种分子检测测定，包括：用浓度为3M至3.5M、pH为5.0至5.5的亚硫酸氢盐试剂在温度80℃至95℃直接处理能够...

【专利技术属性】
技术研发人员：道格拉斯·斯潘塞·米勒，
申请(专利权)人：人类遗传标记控股有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU