条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法技术

本发明专利技术公开了一种条形叶植物叶绿体DNA的提取方法，包含如下步骤：A、通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核；B、通过差速离心处理去除步骤A所得产物中的杂物对叶绿体进行粗提；C、通过密度梯度离心去除步骤B所得产物中的杂物对叶绿体进行纯化；D、采用天根生化快捷型植物基因组DNA提取系统对步骤C所得产物进行提取，获取高纯度的叶绿体DNA。本发明专利技术的方法能够对条形叶植物叶绿体DNA进行高纯度、高质量的提取。

High purity and high quality extraction method of chloroplast DNA from stripe leaf plant

The invention discloses a method for extracting a strip of chloroplast DNA, which comprises the following steps: A, by making mechanical trauma on the blade and combined with enzyme treatment means to obtain leaf protoplasts, the protoplast contained chloroplast, mitochondria and nucleus; B, through differential centrifugation to remove the product obtained in step A the debris was extracted on chloroplast; C, by density gradient centrifugation to remove product obtained in step B debris of chloroplast was purified; D, using Tiangen biochemical fast type plant genomic DNA extraction system to extract step C NbSe2, obtaining high purity of chloroplast DNA. The method of the invention can carry out high-purity and high quality extraction of chloroplast DNA of a strip-shaped leaf plant.

【技术实现步骤摘要】
条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法
本专利技术涉及一种植物核苷酸提取技术，具体涉及一种高纯度小提大量小型条形叶植物叶绿体DNA的提取方法。
技术介绍
叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，也是细胞质中具有遗传功能的主要细胞器之一,作为半自主性细胞器，其功能是叶绿体基因组和核基因组相互作用的结果(贾婧婧等.,2009)。与核基因组相比，叶绿体等细胞器基因组结构简单、分子量小、且多拷贝，不易于重组，因而，在一定程度上保留了植物的进化信息(荆玉祥,1985)。其基因含量、顺序上的保守性以及较低的重组率，使细胞器基因组更适合用来做系统进化、发育研究，用于植物细胞质类型划分，结果将更可靠，上述功能又和叶绿体基因组的测序及序列和结构分析密切相关，因此，有关叶绿体DNA及其遗传的研究显得尤为重要，而这些都必须以高质量的叶绿体DNA提取为基础。自20世纪80年代以来，由于各种植物尤其是小型条形叶植物都很难提取到高浓度、高质量的叶绿体，严重影响了叶绿体相关研究的深入开展，受此影响，小型条形叶植物中，只有水稻的叶绿体进行了测序，但是，水稻的测序也不是以高纯度水稻的叶绿体为基础进行，而是以类似特异标签通过长片段PCR的方式进行测序的(Moonetal.,1987)，这种方法远不如直接提取高纯度叶绿体测序的方式精准、快捷。谷子、小麦等绝大部分小型条形叶植物的叶绿体未进行测序，为此，关于叶绿体提取和纯化方法改进的报道不断出现。但是，这些方法由于存在难以克服的缺陷，都很难提取到高纯度、高质量的叶绿体，归纳起来，关键性制约因素有2个，其一是提取不到高浓度的完整叶绿体，第二是难以将细胞核和线粒体彻底去除，从而获取高纯度无污染的叶绿体。在获得高浓度的叶绿体方面，主要受两个因素的影响，其一是在破碎细胞的过程中，既要使植物细胞充分释放出所有的叶绿体，又要使叶绿体尽可能的保持完整。为此，科研人员进行了不断的探索，先后提出了液氮固定研磨(孙晓荣等.,2012;肖龙etal.,2016)、常规溶液匀浆(沈志伟等.,1989)和Vc匀浆系统(赵衍等.,1991)等，但是，由于这些方法仍存在液氮固定研磨破坏叶绿体和匀浆处理叶绿体不能充分释放等缺点，很难提取到高浓度的叶绿体。第二是在叶绿体提取过程中如何防止叶绿体被氧化。植物细胞中具有很多的次生代谢物质，而叶绿体是进行氧化还原反应的场所，对氧胁迫非常敏感，因而，这些次生代谢物的氧化会对叶绿体造成破坏，从而导致提取到完整叶绿体的浓度很低，因此，查明叶绿体次生代谢物被氧化的机制，在提取过程中合理改变提取条件，防止叶绿体被氧化的方法成为获取高浓度叶绿体的又一关键因素。在去除细胞核和线粒体污染方面，科研人员也进行了一些探索，先后提出了DNase1去除核DNA(Edelmanetal.,1982;史公军等.,2005)，密度梯度离心(Heinhorstetal.,1988;Hiraietal.,1985;肖龙等.,2016)、差速离心方法(欧立军等.,2006;史公军等.,2005;谢海坤等.,2016)去除细胞核和线粒体，从而获取高质量叶绿体。但是，由于DNase1对所有的DNA均有降解作用，依赖于细胞核DNA释放而叶绿体DNA未释放的时间差，不能完全保证去除核DNA；况且这些方法较少将密度梯度离心和差速离心结合在一起，很难同时将细胞核和线粒体同时去除。孙富等在甘蔗叶绿体蛋白提取的研究中，虽然采用了差速离心与密度梯度离心(孙富等.,2011)，但是，由于其在差速离心时采用1500g分离叶绿体，离心力没有达到学界公认的叶绿体3,000g的沉降离心力，浪费了大量的完整叶绿体，且细胞破碎采取匀浆法，不能释放其大量的叶绿体，用于提取甘蔗等大型叶叶绿体含量比较丰富的植物叶绿体尚可，却不适用于谷子、小麦等小型条形叶植物叶绿体的分离。且植物细胞核和叶绿体沉降系数差异不大，单纯通过差速离心不能够将细胞核去除干净；而线粒体和叶绿体密度差异较小，单纯通过密度梯度离心很难将线粒体去除干净。必须根据叶绿体和细胞核的密度差异、以及其和线粒体的沉降系数差异，建立适宜小型条形叶植物叶绿体提取的密度梯度和离心速差，并将它们结合在一起才能彻底去除细胞核和线粒体对叶绿体提取过程中的污染。在此基础上，施菲等通过系列技术改进，近年又专利技术了茶树叶绿体DNA的分离方法(施菲和李威,2013)，但是，由于茶树叶片大且肥厚，提取叶绿体相对比较容易，而谷子、小麦等小型条形叶植物，叶片薄，叶肉细胞少，叶绿体含量较少，因此，直接采用茶树等果树、林木叶绿体提取方法提取的小型条形叶植物叶绿体不但浓度低，且污染较重，根本提取不到高质量、高浓度的叶绿体DNA，况且，这种方法的细胞破碎仍然采取匀浆法，去除细胞核和线粒体则单纯的采用差速离心法,在小型条形叶植物叶绿体提取中无法应用。鉴于此，袁进成、王小纯等又分别提出了谷子叶绿体DNA的快速提取方法和小麦完整叶绿体的制备方法(袁进成等.,2008;王小纯等，2016)，但是，这些方法也是采用匀浆研磨法破碎细胞和单一的差速离心或密度梯度去除核或线粒体污染，因此，仍无法提取到高纯度无污染的叶绿体DNA。本研究的相关
技术介绍
文献可参考：Edelman,G.M.,Hallick,R.B.,andChua,N.H.(1982).MethodsinchloroplastmolecuLarbiology(ElsevierBiomedicalPress;)。Heinhorst,S.,Gannon,G.C.,Galun,E.,Kenschaft,L.,andWeissbach,A.(1988).ClonebankandphysicalandgeneticmapofpotatochloroplastDNA.TheoreticalandAppliedGenetics75,244-251。Hirai,A.,Ishibashi,T.,Morikami,A.,Iwatsuki,N.,Shinozaki,K.,andSugiura,M.(1985).RicechloroplastDNA:aphysicalmapandthelocationofthegenesforthelargesubunitofribuLose1,5-bisphosphatecarboxylaseandthe32KDphotosystemIIreactioncenterprotein.TheoreticalandAppliedGenetics70,117-122。Moon,E.,Kao,T.H.,andWu,R.(1987).RicechloroplastDNAmolecuLesareheterogeneousasrevealedbyDNAsequencesofaclusterofgenes.NucleicAcidsResearch15,611。贾婧婧,潘小军,张敏,胡勇,何奕昆(2009).叶绿体的遗传进化.生物学通报44,7-9。荆玉祥(1985).叶绿体的遗传信息.植物学报3,8-13。欧立军,黄光文,王京京,陈良碧(2006).水稻叶绿体DNA提取和纯化方法优化.湖南师范大学自然科学学报29,92-94。沈志伟,孙崇荣,朱俭(1989).水稻叶绿体DNA的本文档来自技高网...

【技术保护点】
条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：该方法通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核。

【技术特征摘要】
1.条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：该方法通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核。2.根据权利要求１所述的条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：该方法在获取叶片原生质体后，通过密度梯度离心和差速离心相结合的手段同时将线粒体和细胞核去除干净。3.根据权利要求１或2所述的条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：该方法包含如下步骤：A、叶片原生质体分离：通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核；B、叶绿体的粗提：通过差速离心处理去除步骤A所得产物中的杂物对叶绿体进行粗提；C、叶绿体的纯化：通过密度梯度离心去除步骤B所得产物中的杂物对叶绿体进行纯化；D、叶绿体DNA的提取：采用快捷型植物基因组DNA提取系统对步骤C所得产物进行提取，获取高纯度的叶绿体DNA。4.根据权利要求3所述的条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：步骤A包含如下分步骤：A-1、叶片组织的培养与获取：将目的植物的种子种于育苗盘，并于抽穗前剪取新鲜、健康叶片；A-2、叶片组织的处理：用刀片将步骤A-1所得叶片沿纵和/或横方向进行交叉切割，造成密集的纹状或格状创伤面，以利后续处理；A-3、原生质体的分离：将步骤A-2处理好的叶片置于酶解液中，使酶解液淹没叶片，于黑暗中用脱色摇床30rpm摇动处理3h；叶片与酶解液比例为30g：50-150mL；A-4、原生质体的收集：用buffer1稀释步骤A-3所得酶解物后，用200目细胞筛过滤，收集滤液，弃渣；滤液4oC、200g，离心10min，收集沉淀，即得。5.根据权利要求4所述的条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：所述酶解液的配方如下表所示：纤维素酶0.5g/100mL离析酶0.3g/100mLMannitol0.4MKCl20mMMES,pH=5.720mM55oC加热10min，冷却后CaCl210mMBSA0.1g/100mL。6.根据权利要求3所述的条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：步骤B包含如下步骤：B-1、将步骤A所得原生质体用50mL的buffer2悬浮，然后置于冰上，期间每5min上下颠倒1次，共3次；B-2、步骤B-1所得悬浮液在4oC、500g、离心10min，收集上清，弃沉淀以去除部分细胞核等杂物；B-3、B-2所得上清液在4oC、3,000g、离心15min，弃上清以去除线粒体等细胞器杂物，收集沉淀，所得沉淀即为粗提叶绿体。7.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹，陈超，刘正理，王丽娜，冯刚，李强，梁丹，王从磊，王建贺，时晓伟，石斯发，赵子龙，吕文杰，
申请(专利权)人：唐山师范学院，天津市农作物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13