BAC克隆DNA的提取方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学和分子遗传学及细胞生物学领域，特别涉及到DNA的提取和纯化方法。本发明专利技术采用了磁珠分离与分子筛过滤技术，结合蛋白酶消化技术，发明专利技术了BAC克隆DNA的稳定提取方法。本发明专利技术利用优化的悬浮、裂解、中和缓冲液获取粗制DNA沉淀；经重悬DNA沉淀，在适宜的pH和离子浓度下，将DNA多聚核苷酸大分子非特异性和可逆地结合到磁性纳米材料的官能基团；通过快速结合、清洗步骤，去除裂解过程的离子、蛋白、糖类等污染物和小分子等杂质；经蛋白酶进一步消化、纯化和过滤装置的浓缩后产生出纯化的DNA产物。本发明专利技术操作简单稳定、经济高效、无毒无污染。本发明专利技术具备优良的扩展性，能实现标准化的试剂盒套装系列产品和全自动化操作。

Extraction of DNA from BAC

The invention relates to the molecular biology and the molecular genetics and the cell biology field, in particular to the extraction and purification method of DNA. The invention adopts magnetic bead separation and molecular sieve filtration technology, and combines protease digestion technology, and has invented a stable extraction method of BAC clone DNA. The invention uses optimized suspension, cracking, and buffer solution to obtain crude DNA by suspending precipitation; DNA precipitation, with appropriate pH and ion concentration, DNA polynucleotide molecules and non reversible binding to specific functional groups of magnetic nano materials; through fast combination, the cleaning step, the removal process of cracking the ion, protein, carbohydrate and other pollutants and small molecular impurities; concentrated by protease digestion, further purification and filtration device after produce DNA purification. The invention has the advantages of simple operation, stability, economy, high efficiency, no toxicity and no pollution. The invention has excellent extensibility, and can realize standardized reagent kit series products and fully automatic operation.

【技术实现步骤摘要】
BAC克隆DNA的提取方法
本专利技术涉及分子生物学和分子遗传学及细胞生物学领域，特别涉及到DNA的提取和纯化方法。
技术介绍
近十几年来，分子生物学和细胞遗传学发展迅速，涉及DNA的测序、克隆、功能分析及鉴定的技术在医学、农林业、环境、海洋、法医学等领域得到广泛而深入的应用。BAC(bacterialartificialchromosome)克隆是当前存储、扩增DNA大片断，特别是基因组DNA大片断的主要方法。BAC克隆长度一般在100kb至300kb不等。由于BAC克隆插入DNA片断较大，转染大肠杆菌后所产生的拷贝数较低。无论是现有的离子交换柱法，还是手工方法提取均有一些缺陷和难于克服的困难。现有提取与纯化方法仍主要采用离子交换柱分离方法。如QIAGEN公司的PlasmidMaxiKit(CatNo.12163)、OmegaBio-tek公司的BAC/PACDNAMaxiKit(D2154-01)，这些商用化试剂盒一般能够满足日常试验中低于10ug和片断大小低于100kb的提取需要。离子交换柱提取法所收获的DNA产量一般较低，特别在大片断DNA提取过程中，有时很不理想。同样，大容量的商业化提取试剂盒价格一般较高昂。有些试剂盒在某种程度上也存在可靠性与稳定性的问题。为克服柱法提取的问题，同时为了节省成本，不少研究与应用技术人员采用了手工操作的方法提取DNA，但其中多数方法中应用了酚、氯仿等有毒有害的有机溶剂，对实验人员和环境危害很大。同时，手工提取过程也极易导致DNA产物被有机溶剂污染，直接影响下游实验。采用传统的手工抽提，DNA的降解程度高，一般从500ml培养液中其DNA产物量远低于10ug。DNA降解后的小分子片段也会影响DNA计量的准确性。图1为应用碱性裂解法，然后用苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)混合物提纯，最后用异丙醇(isopropylalcohol)沉淀出的DNA结果。从图1中可以很明显地观察到在低于100bp的位置存在了大量的DNA降解后的小分子片断。这些小分子片断会造成260nm处核酸吸光值超常放大，从而在分光光度计位于260nm处的吸光值呈现出异常高的数值，使260/280及260/230的比值呈现出远大于正常量的情况。这种不正常的260读数会导致DNA计量的错误。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述大片段DNA提取过程存在的DNA易水解、数量少、易污染、成本高的问题，提供一种从大体积BAC克隆细菌培养液中提取质量高、数量充分、无毒、无污染、成本低的DNA的提取技术，从根本上解决BAC克隆大片断DNA的提取纯化问题，同时提供了自动化纯化大片断DNA的可能性。本专利技术是采用以下的技术方案实现的：一种BAC克隆DNA的提取方法，其主要步骤包括：(1)BAC克隆大肠杆菌培养：于2mL的LB培养液中加入微量E.coli(大肠杆菌)BAC克隆的冻存原液并进行初始培养4至6小时，从初始培养液中制作克隆平盘，从过夜培养的平盘中挑取克隆并植入500mL含相应抗生素的LB培养液中过夜培养；(2)细菌裂解：将500mL的大肠杆菌培养液进行离心，获取细菌沉淀物，细菌沉淀再经过悬浮，裂解，中和，离心，去除大部分裂解后的杂质，抽取其中上清；(3)DNA沉淀：将含有DNA的上清液与一定体积的异丙醇混合并离心，获取DNA粗制沉淀物；(4)第一次抽提、清洗：DNA粗制沉淀物经TE缓冲液悬浮后与一定比例的磁珠混合，清洗磁珠，获取较纯DNA；(5)第二次抽提、清洗：将步骤(4)获得的DNA再经一定比例的磁珠纯化；(6)DNA再纯化及浓缩：经磁珠提取的DNA进一步通过10kD超滤离心管浓缩，去除微量盐、低分子量核酸与蛋白杂质，最终获取高质量高纯度DNA产物。上述技术方案，进一步地，在进行步骤(5)第二次抽提、清洗之前，将步骤(4)得到的DNA加入蛋白酶消化液，经酶反应消化残存蛋白质。上述技术方案，进一步地，所述步骤(2)将500mL大肠杆菌培养液平均倒入两只500ml离心管中，4℃在7000xg离心力下离心10分钟；向细菌沉淀物中加入6mL细菌悬浮缓冲液,在高速振荡器上用移液管将菌体沉淀搅散，最后用移液枪与10mL移液管彻底将菌体打散、悬浮，将打散后的菌体转移至两只50mL离心管中；向离心管中加入6mL细菌裂解液，轻轻反转4至5次，于室温静置3至5分钟，立即向裂解中的菌体加入6mL中和液，轻轻反转混匀4至5次，放置于冰上，3至5分钟后至菌体絮状物完全由棕色转为白色，将离心管安置于离心转子，于4℃以12000xg离心10分钟。上述技术方案，进一步地，所述步骤(2)去除裂解后的杂质的具体方法为：将离心后的离心管置于冰上，用移液管抽取离心管中的上清液，将所有上清液逐次转移到过滤管中，上清液在重力作用下经过过滤管底部的棉纱过滤后自然流到50mL离心管中，直至所有上清全部收集于离心管中；所述过滤管的制作步骤为：取10mL注射器，用剪刀剪出5平方厘米的医用灭菌脱脂棉纱，并用注射器推塞填塞于注射器内底部，然后拔掉推塞；所述过滤管固定设置在50mL离心管内，喷口朝向50mL离心管。上述技术方案，进一步地，所述步骤(3)获取DNA粗制沉淀物的具体方法为：计算离心管中的上清液体积，按照上清液体积的0.7倍向离心管中加入纯异丙醇，将离心管安置于离心转子，于4℃以4000xg离心15分钟，将离心后的DNA沉淀弃去上清液后，再以4000xg离心1分钟，弃去上清液，获得半透明状DNA初步提取后的沉淀物，立即向DNA沉淀物中加入500μLTE缓冲液并用移液枪将沉淀物悬浮溶解于TE缓冲液中。上述技术方案，进一步地，所述步骤(4)将DNA悬浮液转移至900μL(1.8x)AgencourtXP磁珠中，反转并充分混匀后于室温下静置5分钟，使DNA与磁珠充分结合；轻轻离心后放置于磁力架，静置3至5分钟；用移液枪或负压弃去所有上清液，加入1mL70％的酒精，合上离心管盖，在磁力架上旋转3至4次离心管，使磁珠充分于酒精中清洗，弃去酒精，再次加入新鲜的1mL70％酒精，重复一次清洗过程；磁珠清洗2次后，弃去酒精，将磁珠离心后再次安放于磁力架，用移液枪彻底弃去残存酒精；于室温下静置30分钟，或于37℃加热盘中加温5分钟再静置于磁力架，直到磁珠团块因干燥开始出现出细小的裂缝；向干燥后的磁珠加入200μL65℃预热的TE缓冲液，充分混匀、离心后置于磁力架5分钟，抽取上清，转移至1.5mL实验管，其中含有洗提出的DNA；再次加入200μL65℃预热的TE缓冲液抽提磁珠，充分混匀、离心后置于磁力架5分钟，抽取上清，合并提取的DNA上清液。上述技术方案，进一步地，所述步骤(5)将第一次提取的DNA溶液转至650μL(1.6x)AgencourtXP磁珠中，混匀后于室温静置5分钟，使DNA与磁珠充分结合；轻轻离心后放置于磁力架，静置3至5分钟；用移液枪或负压弃去所有上清液，加入1mL70％的酒精，合上离心管盖，在磁力架上旋转3至4次离心管，使磁珠充分于酒精中清洗，弃去酒精，再次加入新鲜的1mL70％酒精，重复一次清洗过程；磁珠清洗2次后，弃去酒精，将磁珠离心后再次安放于磁力架，用移液枪彻底弃去残存酒精；于室温下静置30分钟，或于37℃加热盘中加温5分钟再静置于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种BAC克隆DNA的提取方法，其特征在于，其主要步骤包括：(1)BAC克隆大肠杆菌培养：于2mL的LB培养液中加入微量大肠杆菌BAC克隆的冻存原液并进行初始培养4至6小时，从初始培养液中制作克隆平盘，从过夜培养的平盘中挑取克隆并植入500mL含相应抗生素的LB培养液中过夜培养；(2)细菌裂解：将500mL的大肠杆菌培养液进行离心，获取细菌沉淀物，细菌沉淀再经过悬浮，裂解，中和，离心，去除大部分裂解后的杂质，抽取其中上清；(3)DNA沉淀：将含有DNA的上清液与一定体积的异丙醇混合并离心，获取DNA粗制沉淀物；(4)第一次抽提、清洗：DNA粗制沉淀物经TE缓冲液悬浮后与一定比例的磁珠混合，清洗磁珠，获取较纯DNA；(5)第二次抽提、清洗：将步骤(4)获得的DNA再经一定比例的磁珠纯化；(6)DNA再纯化及浓缩：经磁珠提取的DNA进一步通过10kD超滤离心管浓缩，去除微量盐、低分子量核酸与蛋白杂质，最终获取高质量高纯度DNA产物。

【技术特征摘要】
1.一种BAC克隆DNA的提取方法，其特征在于，其主要步骤包括：(1)BAC克隆大肠杆菌培养：于2mL的LB培养液中加入微量大肠杆菌BAC克隆的冻存原液并进行初始培养4至6小时，从初始培养液中制作克隆平盘，从过夜培养的平盘中挑取克隆并植入500mL含相应抗生素的LB培养液中过夜培养；(2)细菌裂解：将500mL的大肠杆菌培养液进行离心，获取细菌沉淀物，细菌沉淀再经过悬浮，裂解，中和，离心，去除大部分裂解后的杂质，抽取其中上清；(3)DNA沉淀：将含有DNA的上清液与一定体积的异丙醇混合并离心，获取DNA粗制沉淀物；(4)第一次抽提、清洗：DNA粗制沉淀物经TE缓冲液悬浮后与一定比例的磁珠混合，清洗磁珠，获取较纯DNA；(5)第二次抽提、清洗：将步骤(4)获得的DNA再经一定比例的磁珠纯化；(6)DNA再纯化及浓缩：经磁珠提取的DNA进一步通过10kD超滤离心管浓缩，去除微量盐、低分子量核酸与蛋白杂质，最终获取高质量高纯度DNA产物。2.根据权利要求1所述的BAC克隆DNA的提取方法，其特征在于，在进行步骤(5)第二次抽提、清洗之前，将步骤(4)得到的DNA加入蛋白酶消化液，经酶反应消化残存蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的BAC克隆DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)将500mL大肠杆菌培养液平均倒入两只500mL离心管中，4℃在7000xg离心力下离心10分钟；向细菌沉淀物中分别加入6mL细菌悬浮缓冲液,在高速振荡器上用移液管将菌体沉淀搅散，最后用移液枪与10mL移液管彻底将菌体打散、悬浮，将打散后的菌体转移至两只50ml离心管中；向离心管中分别加入6ml细菌裂解液，轻轻反转4至5次，于室温静置3至5分钟，立即向裂解中的菌体分别加入6ml中和液，轻轻反转混匀4至5次，放置于冰上，3至5分钟后至菌体絮状物完全由棕色转为白色，将离心管安置于离心转子，于4℃以12000xg离心10分钟。4.根据权利要求3所述的BAC克隆DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)去除裂解后的杂质的具体方法为：将离心后的离心管置于冰上，用移液管抽取离心管中的上清液，将所有上清液逐次转移到过滤管中，上清液在重力作用下经过过滤管底部的棉纱过滤后自然流到50mL离心管中，直至所有上清全部收集于离心管中；所述过滤管的制作步骤为：取10ml注射器，用剪刀剪出5平方厘米的医用灭菌脱脂棉纱，并用注射器推塞填塞于注射器内底部，然后拔掉推塞；所述过滤管固定设置在50mL离心管内，喷口朝向50mL离心管。5.根据权利要求4所述的BAC克隆DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)获取DNA粗制沉淀物的具体方法为：计算离心管中的上清液体积，按照上清液体积的0.7倍向离心管中加入纯异丙醇，将离心管安置于离心转子，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张进平，张晓春，
申请(专利权)人：青岛安德贝生命科技有限公司，青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：山东,37