一株胶原酶生产菌株及其胶原酶基因序列与应用制造技术

本发明专利技术涉及一株产胶原酶蜡样芽胞杆菌

Strain producing collagenase and its collagenase gene sequence and Application

The present invention relates to a Bacillus cereus producing collagenase

【技术实现步骤摘要】
一株胶原酶生产菌株及其胶原酶基因序列与应用
本专利技术属于工业微生物筛选应用
，具体涉及一株生产胶原酶的菌株，同时涉及一种胶原酶编码基因colc及其氨基酸序列，以及其编码胶原酶在胶原蛋白降解过程中的应用。
技术介绍
胶原蛋白，又名胶原，英文名Collagen，作为一种结构蛋白存在于细胞外的基质中，是一种白色、不透明、无支链的纤维型蛋白质，其分子量约为300kDa。它以不溶性纤维的形式广泛存在于动物骨、脚、软骨、皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白量的三分之一，相当于体重的6%。在动物体内，其主要功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，起到支撑器官和保护机体的功能，因此胶原蛋白广泛应用于护肤、护发产品、美容整形品和医药品材料等。除此之外，胶原蛋白也是动物体内蛋白质结构最特殊者，它由三条多肽链构成三股螺旋结构，三条多肽链的每条都左旋形成左手螺旋结构，再以氢键相互咬合形成牢固的右手超螺旋结构。由于其具有独特的三股超螺旋结构，使其性质十分稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解，以及其高分子量，从而造成胶原蛋白大分子消化吸收困难，不易被人体充分利用。胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶（Collagenase），它能在生理pH和温度条件下特异性的水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其他蛋白质的组织。其特异水解胶原蛋白的产物胶原三肽，相比大分子的胶原蛋白则在消化吸收、营养、功能特性等方面都会得到显著的提高。它不仅具有可以直接补充人体的胶原蛋白，达到延缓皮肤衰老达到美容养颜的功效，并且具有更易消化吸收、保护胃黏膜及抗溃疡、抗过敏、降血压、抗氧化、降胆固醇、抗衰老、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮损伤的修复和促进角膜上皮的生长等多种生理活性。另外，通过水解将大分子的胶原蛋白转化成主要含有短肽和氨基酸的水解物，可以改善胶原蛋白的水溶性，方便加工，有利于开拓其食品用途，使其产品更利于机体的吸收，因此胶原酶使得胶原蛋白在食品、医药、化妆品等领域有着更为广阔的市场和前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株能胞外产胶原酶的蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15，现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC11167，保藏时间为2015年8月4日。该菌株来源于天津肉联厂附近土壤样品，通过富集培养、透明圈初筛、复筛分离、筛选得到，经形态、生理生化特征、16SrDNA鉴定，本专利技术的胶原酶生产菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus），将其命名为蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15。其中菌株Col15的16SrDNA具体序列详见序列表SEQIDNO.1，其GenBank的编号为KT726339。通过茚三酮显色反应测定胶原酶酶活，本专利技术菌株所产胶原酶的酶活力为26.7±1.9U/mL。其中本专利技术对胶原酶酶活的定义为：在37℃，pH7.5条件下，每分钟水解胶原蛋白产生相当于1μg甘氨酸的酶量为1个酶活力单位（U）。本专利技术的另一个目的是提供一种利用该蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15制备、纯化分子量大小约100kDa胶原酶的方法。首先，对该菌株产酶的发酵培养基成分进行了优化，其最适碳源为葡萄糖，最适氮源为胰蛋白胨，优化后发酵培养基成分为：葡萄糖20g/L，酵母粉1.5g/L，胰蛋白胨15g/L，CaCl20.05g/L，MgCl2·6H2O0.165g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，NaH2PO4·2H2O0.5g/L，调整pH7.5。对该菌株产酶的发酵条件进行优化后发现，发酵最适温度为37℃，pH值的最适范围为6.0-9.0。然后，通过离心取得发酵上清液，即胶原酶的粗酶液，将该上清液经由0.22μm的中空纤维膜过滤，滤液于截留分子量为30kDa的切向流超滤器进行浓缩，制得的浓缩液于阴离子交换柱进行分离纯化。根据以上制备步骤，从蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15中制备出纯化的胶原酶，经SDS-PAGE确定，其分子量约为100kDa。最终经发酵、制备出的胶原酶SDS-PAGE如图2所示。以上利用蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15制备胶原酶的过程相对简单，周期相对短暂，操作环节简便，工作量小，并且利用该制备方法尽可能降低了蛋白的损失，使得胶原酶的收率较高。本专利技术的第三个目的是针对现有蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15生产胶原酶的产量相对较低，不利于其应用到批量生产中，因此提供一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的编码基因colc以及该基因的异源表达及纯化方法。该蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15胶原酶基因colc，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，在GenBank的编号为KT593866，其所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。根据16SrDNA的同源性比对结果，选取与蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15亲缘关系最近菌株的胶原酶基因设计引物，通过PCR方式克隆得到该菌株的胶原酶基因colc，并将其连接到表达载体，转化到大肠杆菌中，获得异源表达胶原酶的重组大肠杆菌菌株。经摇瓶发酵、IPTG诱导、高压破碎获得该重组蛋白的粗酶液，粗酶液经镍柱亲和层析和强阴离子交换柱纯化得到重组胶原酶纯化产物。本专利技术的蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）Col15具有培养时营养要求简单、生长快速，生产制备纯品胶原酶的过程简单等优点，所产胶原酶酶活力高，且具有对大多数金属离子不敏感、pH适用范围广泛、温度耐受能力较强等特点，较适合用于产业化放大生产。同时本专利技术提供编码该菌株胶原酶的基因colc，并建立该基因异源表达和制备的方法，弥补了蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）Col15产酶量较低等弊端。异源表达的胶原酶与原始菌Col15发酵生产的胶原酶，其降解胶原蛋白的酶活力相当，对比现有报道胶原酶的酶活力，属胶原酶酶活力较高的蛋白酶。以上优点使得该蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）Col15发酵所产胶原酶或者异源表达的胶原酶在降解胶原蛋白以及在利用胶原蛋白水解产物等方面具有更广泛的应用前景。附图说明图1为本专利技术胶原酶产生菌Col15菌落形态图；图2为本专利技术制备纯化胶原酶SDS-PAGE检测；图3为大肠杆菌异源表达纯化重组胶原酶的SDS-PAGE检测；图4为葡萄糖浓度对菌株Col15产酶的影响；图5为胰蛋白胨浓度对菌株Col15产酶的影响；图6为培养基初始pH对菌株Col15产酶的影响；图7为培养温度对菌株Col15产酶的影响；图8为重组胶原酶最适反应温度；图9为重组胶原酶最适反应pH；图10为不同金属离子对重组胶原酶酶活的影响；图11为重组胶原酶的温度稳定性。具体实施方式以下结合具体的实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1菌株Col15的筛选、鉴定与产酶性质一、产胶原酶菌株Col15的筛选申请人以天津肉联厂附近采集的土样样品作为基质，按照一定比例分别以无菌水和鸡蛋清混匀后，再加入小片的猪皮和鱼皮，于25~30℃条件下富集培养；然后稀释后涂布到含有2%明胶的LB平板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株产胶原酶的菌株，其特征是该菌株为蜡样芽胞杆菌（

【技术特征摘要】
1.一株产胶原酶的菌株，其特征是该菌株为蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15，其保藏编号为CGMCC11167。2.如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15在纯化及制备胶原酶的应用。3.一种源自如权利要求1所述蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）Col15的胶原酶基因colc，其特征是该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.如权利要求3所述胶原酶基因colc编码的胶原酶ColC，其特征是该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。5.含有权利要求3所述的核苷酸序列的表达载体及含有此表达载体的重组细胞。6.如权利要求5所述的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、枯草芽...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱玥明，李星硕，曾艳，门燕，管于平，柏玮，孙媛霞，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12