一种增加γ‑聚谷氨酸发酵液溶氧的方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵领域。目的是提供一种具有普适性的增加γ‑聚谷氨酸发酵液溶氧的方法。采用的技术方案是：一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JX‑6，保藏编号为：CGMCC No.13715。将该菌株接种于已灭菌的斜面活化培养基，培养得到活化菌种；将所述活化菌种接种于已灭菌冷却的种子培养基中，培养得到种子液；将所述种子液接种在发酵培养基中，发酵过程中添加固态氧，培养完成后得到发酵液。本发明专利技术普适性强，操作简单、成本低廉、无二次污染、对菌株无耐受性要求、便于大规模应用于生产，具有良好的应用前景。

A method of increasing gamma poly glutamic acid fermentation liquid oxygen

The invention belongs to the field of microbial fermentation. The purpose is to provide a method of universal gamma polyglutamic acid increase fermentation liquid oxygen. The technical scheme is as follows: Bacillus amyloliquefaciens strain (Bacillus amyloliquefaciens JX) 6, the preservation number is: CGMCC No.13715. The slope of the strain is inoculated in sterile culture medium activation, activation of bacteria; the activation of inoculation with sterilized seeds of cooling medium, cultured seed liquid; the seeds were inoculated in fermentation medium, adding solid oxygen in the fermentation process, fermentation liquid obtained after the completion of training. The invention has the advantages of high universality, simple operation, low cost, no two pollution, no tolerance for strains, and convenient for large-scale application in production, and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法
本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法。
技术介绍
γ-聚谷氨酸是由L-谷氨酸或者D-谷氨酸通过γ-酰胺基结合形成的一种水溶性的生物高分子聚合物。具有很强的吸水性，可降解性，水解性等众多特性，因此被广泛用于食品、农业、医药、绿化以及水处理等多个领域，具有极大的开发价值和应用前景。γ-聚谷氨酸的制备方法有化学合成、生物提取和微生物发酵三种方法。微生物发酵法比前两种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，所以现在主要采用微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸，主要生产菌是芽孢杆菌属的菌株，包括各种(纳豆)枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。微生物发酵生产γ-聚谷氨酸分为固态发酵和液态发酵，目前γ-聚谷氨酸发酵以液体发酵为主。液体发酵过程中随着发酵时间的延长，发酵液粘度逐渐增加，氧气的传质系数及氧气的利用率逐渐降低，溶氧不足进而影响发酵的进行，氧限制已成为影响γ-聚谷氨酸液体发酵的一个重要因素，严重制约了γ-聚谷氨酸发酵产量的提高。邹水洋等(公开号CN102533885A)采用向发酵培养基中补加NaCl，通过降低发酵液粘度进而增加发酵液中的溶氧，在添加3％～6％的NaCl后γ-聚谷氨酸产量较对照提高10％～40％，最高产量达到29.76g/L。但该专利方法只适用于高盐耐受菌株，对绝大部分盐度耐受度不高的菌株不具有适用性。李海军等(公开号CN103881954A)在枯草芽孢菌株FRD518染色体上重组整合了透明颤菌的血红蛋白基因(vgb)，并成功高效表达透明颤菌血红蛋白VHb，显著提高了重组枯草芽孢杆菌低溶氧条件下对氧的利用率，重组后菌株γ-聚谷氨酸产量达到65g/L较原始菌株提高了147％，但基因工程菌株的遗传不稳定性以及基因工程菌株安全问题等因素也限制了基因工程菌株在发酵制备γ-聚谷氨酸上的应用。因此，亟需开发一种能针对所有γ-聚谷氨酸发酵增加发酵液溶解氧的普适方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株生产γ-聚谷氨酸的菌株。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JX-6，保藏编号为：CGMCCNo.13715；该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏日期为：2017年03月01日。本专利技术从大酱样品中筛选得到，该菌性状特征如下：1)、形态特征：该菌在LB培养基中的营养细胞为杆状，革兰氏阳性，长2～3μm、宽0.7～0.9μm；在37℃培养3～5天形成芽孢，芽孢大小0.4～0.6×0.8～1.5μm，为长圆形或圆柱形。2)、培养性质：该菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板培养：30～40℃培养1天可大量生长，菌落表面凸起，光滑无褶皱，菌落透明，边缘呈规则圆形，菌落粘性大，挑起有丝状。该菌在E型发酵培养基琼脂平板培养：30～40℃培养1d可大量生长，菌落表面凸起、中心凹陷，表面不光滑有褶皱，菌落白色半透明，边缘不规则，菌落表面有液滴，菌落粘性大，挑起有拉丝状。3)、分子生物学鉴定：提取菌株全基因组DNA，PCR扩增16SrDNA片段，测序，测序结果在NCBI中进行比对，比对结果显示该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。4)、生理生化性质：如下表所示：表一.JX-6菌部分生理生化特性注：“+”表示反应为阳性；“-”表示反应为阴性。本专利技术的另一个目的是提供一种具有普适性的增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法。一种增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法，包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌JX-6接种于已灭菌的斜面活化培养基，经活化培养得到活化菌种；将所述活化菌种接种于已灭菌冷却的种子培养基中，经种子液培养得到种子液；将所述种子液接种在发酵培养基中，发酵过程中添加固态氧，发酵完成后得到发酵液；对所述发酵液进行提取、纯化、透析除盐、冷冻干燥制得含γ-聚谷氨酸的成品。优选的：所述的斜面活化培养基由蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L和水组成，pH7.0～7.4；所述的活化培养为30～37℃培养24～48h。优选的：所述的种子培养基由蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L和水组成，pH7.0～7.4；所述的种子液培养为30～37℃摇瓶培养24～48h。优选的：所述的发酵培养基为E型培养基：由柠檬酸10g/L，谷氨酸20g/L，硫酸铵10g/L，甘油80g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeCl3·6H2O0.02g/L，MnSO4·H2O0.1g/L，CaCl20.2g/L和水组成，pH7.0。优选的：所述的发酵培养中，将所述种子液按体积分数2％～10％接种量接种于发酵培养基中，在30～37℃摇瓶培养24～48h；然后将固态氧以溶液状态加入培养基中，添加至固态氧在发酵液中的浓度为50～500μmol/L，继续摇瓶培养至96h，终止发酵。优选的：所述的发酵培养中添加的固态氧为Na2CO4和CaO2中的一种或两者的混合物。优选的：所述的固态氧在发酵液中的浓度为200～400μmol/L。优选的：所述的提取是用硫酸调节发酵液pH至3.0，于4800r/min下离心30min去除菌体；所述的纯化是向提取的上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃静置过夜，离心得γ-聚谷氨酸粗品沉淀；所述的透析除盐是用适量的去离子水溶解粗品，调节pH值为3～4，用透析袋进行脱盐；所述的冷冻干燥是对透析液进行真空冷冻干燥。本专利技术具有以下有益效果：普适性强，操作简单、成本低廉、无二次污染、对菌株无耐受性要求、便于大规模应用于生产，具有良好的应用前景。具体来说，本专利技术通过在发酵液中菌体生长进入稳定期后加入固态氧，增加了发酵液的溶氧量，这样在发酵液变粘后加入既保证了发酵液中有足够量的菌体，又通过固态氧分解释放出氧气解除了氧限制，为后续γ-聚谷氨酸的合成提供了有利环境，使γ-聚谷氨酸产量提高。相较于未添加固态氧的方法，本专利技术可以将γ-聚谷氨酸产量提高近60％。本专利技术采用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JX-6于2017年03月01日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNo.13715。具体实施方式下面具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本专利技术的技术方案和效果，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例一1.制备培养基：a.活化培养基组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，补水至1000mL，pH7.0～7.4，121℃灭菌30min。b.种子培养基组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，补水至1000mL，pH7.0～7.4，121℃灭菌30min。c.发酵培养基组分：柠檬酸10g，谷氨酸20g，硫酸铵10g，甘油80g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，FeCl3·6H2O0.02g，MnSO4·H2O0.1g，CaCl20.2g，pH7.0，补水至1000m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株解淀粉芽孢杆菌，Bacillus amyloliquefaciens JX‑6，其特征在于：其保藏编号为：CGMCC No.13715，该菌在LB培养基中的营养细胞为杆状，革兰氏阳性，长2～3μm、宽0.7～0.9μm；其菌落在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上平板培养为表面凸起，光滑无褶皱，菌落透明，边缘呈规则圆形，菌落粘性大，挑起有丝状。

【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌，BacillusamyloliquefaciensJX-6，其特征在于：其保藏编号为：CGMCCNo.13715，该菌在LB培养基中的营养细胞为杆状，革兰氏阳性，长2～3μm、宽0.7～0.9μm；其菌落在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上平板培养为表面凸起，光滑无褶皱，菌落透明，边缘呈规则圆形，菌落粘性大，挑起有丝状。2.一种增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法，其特征在于：包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌JX-6接种于已灭菌的斜面活化培养基，经活化培养得到活化菌种；将所述活化菌种接种于已灭菌冷却的种子培养基中，经种子液培养得到种子液；将所述种子液接种在发酵培养基中，发酵过程中添加固态氧，发酵完成后得到发酵液；对所述发酵液进行提取、纯化、透析除盐、冷冻干燥制得含γ-聚谷氨酸的成品。3.根据权利要求2所述的增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法，其特征在于：所述的斜面活化培养基由蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L和水组成，pH7.0～7.4；所述的活化培养为30～37℃培养24～48h。4.根据权利要求2所述的增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法，其特征在于：所述的种子培养基由蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L和水组成，pH7.0～7.4；所述的种子液培养为30～37℃摇瓶培养24～48h。5.根据权利要求2所述的增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法，其特征在于：所述的发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫志英，姬高升，许力山，房俊楠，刘晓风，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51