(S)-羰基还原酶异源聚合体及其在催化多苯环化合物的应用制造技术

本发明专利技术公开了(S)‑羰基还原酶异源聚合体及其在催化多苯环化合物的应用，属于生物催化技术领域。本发明专利技术构建了(S)‑羰基还原酶异源聚合体重组菌、获得了异源聚合体SCR/SCR2和SCR2/SCR3，并将其应用于催化2,4‑二氯二苯甲酮和2‑萘乙酮。本发明专利技术的异源聚合体SCR2/SCR3能催化2，4‑二氯二苯甲酮，酶活可达4.42U/mg，而同源聚合体SCR、SCR2和SCR3没有检测到催化上述底物的酶活。本发明专利技术利用异源聚合体蛋白的表达和纯化有效拓展了(S)‑羰基还原酶系(SCR，SCR2和SCR3)的生物催化的底物谱，为多苯类化合物的生物催化提供了新型氧化还原酶。

(S) the application of carbonyl reductase heterologous polymers and in catalysis of polycyclic aromatic compounds

The invention discloses carbonyl reductase (S) and its application in catalytic polymer heterologous polycyclic aromatic compounds, which belongs to the field of biocatalysis technology. The invention constructs (S) carbonyl reductase heterologous polymerization weight group bacteria, obtained the heterologous polymers SCR/SCR2 and SCR2/SCR3, and its application in catalytic 2,4 two chloro two benzophenone and 2 acetonaphthone. The invention of the heterologous polymer SCR2/SCR3 can catalyze 2, 4 two chloro two benzophenone, enzyme activity of 4.42U/mg, SCR, SCR2 and homologous polymer and SCR3 did not detect the catalytic enzyme activity. The invention uses the heterologous expression and purification of protein polymer effectively extends (S) carbonyl reductase (SCR, SCR2, and SCR3) the bio catalytic substrate spectrum and biocatalysis for benzene compounds provides new oxidoreductase.

【技术实现步骤摘要】
(S)-羰基还原酶异源聚合体及其在催化多苯环化合物的应用
本专利技术涉及(S)-羰基还原酶异源聚合体及其在催化多苯环化合物的应用，属于生物催化

技术介绍
手性化合物在医药、农药、激素、食品添加剂等精细化工品的生产上得到了越来越广泛的应用，如联苯化合物2,4-二氯二苯甲酮对南美锥虫病的寄生虫有抑制作用，是一种潜在的药用化合物。而化合物2-萘乙酮作为重要的药物中间体，利用生物法催化该化合物，从而获得各种重要的药物前体也具有很大的价值。氧化还原酶催化的不对称还原反应常用于手性化合物的制备。目前常用的氧化还原酶大部分产自重组型的大肠杆菌。而立体选择性氧化还原酶能用于工业转化手性醇的种类和数量非常有限，尤其是生产(S)-型手性醇的具有anti-Prelog立体选择性氧化还原酶数量更少。因此有必要对现有的氧化还原酶进行改造以获得具有新功能的工程酶，以满足实际需要，获得具有更多功能的手性生物催化剂。专利技术人在前期工作中构建得到了分别表达(S)-羰基还原酶基因簇(scr，scr2和scr3)基因的重组型大肠杆菌(E.coli)，重组菌能够催化转化制备(S)-苯基乙二醇。(S)-羰基还原酶系基因在大肠杆菌(E.coli)中分别异源表达后，对单苯环类化合物具有较好的催化活性。但是(S)-羰基还原酶SCR、SCR2、SCR3的底物谱较窄，无法催化多苯环类化合物。如目前报道(S)-羰基还原酶SCR、SCR2、SCR3同源蛋白聚合体能催化直链潜手性醇和单苯环类潜手性醇化合物，但对于联苯类化合物2,4-二氯二苯甲酮和2-萘乙酮等重要的药物中间体几乎没有催化能力。专利技术内容为了解决上述问题，本专利技术得到了(S)-羰基还原酶的异源聚合体，提高了(S)-羰基还原酶系基因的底物谱。通过蛋白和蛋白的相互作用，异源羰基还原酶聚合体催化底物谱扩大，能够催化双苯环类化合物，如联苯化合物2,4-二氯二苯甲酮和2-萘乙酮。本专利技术的第一个目的是提供一种能够催化多苯环类化合物的异源羰基还原酶聚合体蛋白，所述异源羰基还原酶聚合体蛋白是(S)-羰基还原酶的异源聚合体蛋白复合物。在一种实施方式中，所述异源聚合体蛋白复合物是两个以上氨基酸序列不同的(S)-羰基还原酶形成的异源聚合体。在一种实施方式中，所述(S)-羰基还原酶是来源于近平滑假丝酵母的(S)-羰基还原酶。在一种实施方式中，所述(S)-羰基还原酶可以是：氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的SCR、氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的SCR2、氨基酸序列如SEQIDNO:3所示的SCR3。在一种实施方式中，所述(S)-羰基还原酶的编码基因可以是：scr(GenBankID:DQ675534)、scr2(GenBankID:GQ411433)、scr3(GenBankID:FJ939564)。在一种实施方式中，所述异源聚合体蛋白复合物是由SCR和SCR2形成的异源聚合体SCR/SCR2，或者是由SCR2和SCR3形成的异源聚合体SCR2/SCR3。在一种实施方式中，所述异源聚合体蛋白复合物是将两个以上氨基酸序列不同的(S)-羰基还原酶在同一宿主中共表达而得到的。本专利技术的第二个目的是提供所述异源聚合体蛋白复合物的制备方法。所述方法，是将两个以上氨基酸序列不同的(S)-羰基还原酶在同一宿主中共表达而得到的。在一种实施方式中，所述方法，是将两个以上氨基酸序列不同的(S)-羰基还原酶的基因分别连接到表达载体上，然后转化到同一宿主中得到重组菌，重组菌共表达这两个以上的(S)-羰基还原酶基因，得到异源聚合体蛋白复合物。在一种实施方式中，所述连接到表达载体上，包括每个基因单独连接到一个表达载体上，或者将多个基因连接到同一个表达载体上。在一种实施方式中，所述表达载体可以是以下任意一种或者多种：pET21、pET28、pETDuet。在一种实施方式中，所述宿主可以是大肠杆菌。在一种实施方式中，所述宿主为(E.coliBL21(DE3)。在一种实施方式中，所述连接到表达载体上，还包括在(S)-羰基还原酶的基因前添加蛋白纯化标签。在一种实施方式中，所述方法还包括共表达后的纯化步骤。在一种实施方式中，所述方法具体包括：(1)获取两个氨基酸序列不同的(S)-羰基还原酶的基因；(2)将上一步得到的两个基因分别连接到不同的表达载体上，并进一步构建带有不同纯化标签的含有目的基因的两个重组质粒；(3)将两个重组质粒转化到同一宿主大肠杆菌中，得到共表达两个氨基酸序列不同的(S)-羰基还原酶的重组大肠杆菌；(4)重组菌发酵表达，纯化得到异源聚合体蛋白复合物。在一种实施方式中，所述纯化标签为组氨酸标签或者修饰的链球菌抗生物素蛋白标签。在一种实施方式中，所述纯化，是先收集菌体、破碎细胞得到胞内表达的蛋白，然后离心取上清，先利用Ni-NTAcolumn纯化得到带有组氨酸标签的蛋白，再将得到的带有组氨酸标签的蛋经过StreptrapHPcolumn的纯化，即得到异源聚合体蛋白。因为异源聚合体蛋白既能亲和吸附Ni-NTAcolumn，又能亲和吸附StreptrapHPcolumn。在一种实施方式中，所述纯化，先利用蛋白纯化仪连接镍柱Ni-NTA纯化带有组氨酸标签的蛋白；由于所表达的这两个氨基酸序列不同的(S)-羰基还原酶会形成异源聚合体，因此在这一步中有部分带有strep标签的蛋白也会被Ni-NTA结合；接着将结合在Ni-NTA柱子上的蛋白用含有咪唑的缓冲洗脱，将获得的收集液流经已经用缓冲平衡好的StreptrapHPcolumn上，最后用含有脱硫生物素的缓冲将目的蛋白洗脱，获得异源聚合体蛋白。在一种实施方式中，所述方法具体是：将来源于近平滑假丝酵母的(S)-羰基还原酶SCR、SCR2、SCR3中的任意两种，分别连接到表达载体上并进一步构建带有不同纯化标签的含有目的基因的两个重组质粒，得到pET21-Strep-SCR、pET28-His-SCR2、pET28-His-SCR3、pET21-Strep-SCR2，然后将pET21-Strep-SCR与pET28-His-SCR2，或者pET28-His-SCR3与pET21-Strep-SCR2共同转化到同一宿主细胞大肠杆菌中，筛选具有双质粒的重组大肠杆菌；重组菌发酵表达，纯化得到异源聚合体蛋白复合物。在一种实施方式中，所述发酵表达，是将重组大肠杆菌接种于LB培养基中过夜培养，然后转接于LB培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD达到0.6-0.8时，加入一定浓度IPTG诱导12h。本专利技术的第三个目的是提供表达所述异源聚合体蛋白复合物的重组菌。在一种实施方式中，所述重组菌是将两个以上氨基酸序列不同的(S)-羰基还原酶的基因分别连接到表达载体上，然后共同转化到同一宿主中而得到的。在一种实施方式中，所述宿主是大肠杆菌。在一种实施方式中，所述宿主为(E.coliBL21(DE3)。在一种实施方式中，所述表达载体可以是以下任意一种或者多种：pET21、pET28和pETDuet。在一种实施方式中，所述连接到表达载体上，还包括在(S)-羰基还原酶的基因前添加蛋白纯化标签。本专利技术的第四个目的是提供所述异源聚合体蛋白复合物的应用。在一种实施方式中，所述应用，是应用于催化领域。在一种实施方式中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够催化多苯环类化合物的异源羰基还原酶聚合体蛋白，其特征在于，所述异源羰基还原酶聚合体蛋白是(S)‑羰基还原酶的异源聚合体。

【技术特征摘要】
1.一种能够催化多苯环类化合物的异源羰基还原酶聚合体蛋白，其特征在于，所述异源羰基还原酶聚合体蛋白是(S)-羰基还原酶的异源聚合体。2.根据权利要求1所述的异源羰基还原酶聚合体蛋白，其特征在于，所述异源聚合体是由两个或两个以上氨基酸序列不同的(S)-羰基还原酶形成的。3.根据权利要求1所述的异源羰基还原酶聚合体蛋白，其特征在于，所述(S)-羰基还原酶是来源于近平滑假丝酵母的(S)-羰基还原酶。4.根据权利要求2所述的异源羰基还原酶聚合体蛋白，其特征在于，所述(S)-羰基还原酶是氨基酸序列为SEQIDNO:1所示的SCR、氨基酸序列为SEQIDNO:2所示的SCR2或者氨基酸序列为SEQIDNO:3所示的SCR3。5.根据权利要求4所述的异源羰基还原酶聚合体蛋白，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张荣珍，徐岩，李尧慧，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32