基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种基因工程免疫抑制多肽及制备方法和应用，本发明专利技术分离了一种蛋白质，其序列为ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示的氨基酸序列。基因工各所涉及的引物，将ＬＷＸ－１和ＬＷＸ－ＡＤ－１的核苷酸序列插入表达载体中ｐＧＥＸ－６Ｐ－１，构成重组表达质粒；重组质粒转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），然后细胞裂解经ＧＳＴ亲和层析、小肠激酶切割和色谱纯化得到ＬＷＸ－１和ＬＷＸ－ＡＤ－１，通过质谱鉴定其分子分别为４０７３．１Ｄａ和４６１５．０３Ｄａ。ＬＷＸ－１和ＬＷＸ－ＡＤ－１蛋白质在制备治疗或预防靶向钾通道Ｋｖ１．３、多发性硬化症、风湿性关节炎的药物中的应用。本发明专利技术方法简单易行，操作方便。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，本专利技术涉及一种免疫抑制蝎毒多肽LWX-1和LWX-AD-1 的序列，同时还涉及免疫抑制蝎毒多肽的基因工程制备方法，还涉及多肽鉴定钾通道 Kvl.3的功能及其在制备治疗或预防多发性硬化症、I型糖尿病、风湿性关节炎等T细 胞介导的自身免疫力性疾病的药物的用途。
技术介绍
自身免疫性疾病(autoimmune disease)是指由机体自身产生的抗体或致敏淋巴细 胞破坏、损伤自身的组织和细胞成分，导致组织损害和器官功能障碍的原发性免疫性疾 病。全球约有5_8%的人口受到约40多种自身免疫性疾病的威胁。目前常用对抗自体免 疫性疾病的方法， 一是利用类固醇来减缓因免疫系统攻击组织所造成的炎症反应，二是 使用免疫抑制药物，抑制免疫系统的作用。不过，这两种方法都会造成严重的副作用， 而且都只能减缓病情的发展速度，非根治疾病。在自身免疫性疾病中，以T细胞介导为 主的自身免疫性疾病包括寻常型银屑病、白塞病、自身免疫性甲状腺病、风湿性关节炎、 I型糖尿病和多发性硬化症等。这类疾病在影响着数百万人的生命，针对这种人类难治 疾病的发病机理，研发新型免疫抑制药物已成为全球制药公司激烈竞争的领域之一。近年来，与疾病相关的记忆T细胞上钾通道Kvl. 3被鉴定为治疗自身免疫病的新耙 标，为抢夺未来巨大的药物市场，现在国际上正掀起 一轮以钾通道Kvl. 3为靶标的新药研发热潮。有机小分子药物因价格低廉而成为研发的 首选。Merck公司、澳大利亚Walter and Eliza Hall药物研究技术中心、美国加利福 利亚大学等等机构筛选、分离、合成、改造和鉴定了大量的有机小分子药物候选物 [7>e/ ofe j./ 尸/ anz ac(x/c^7'c37 5"cj'e/7ces， 2004， 25: 280; iV/o/. PAfliTwaco/., 2004， 65: 1364; /o固fl/ 他力Wwfl/ CAe附/琳2006, 49 (4): 1433; Mo人泡wiflCo/" 2005, 68:41254]。这些有机小分子药物作用同源通道Kvl. 1， Kvl. 2, Kvl. 4, Kvl. 5等活性比Kv. 1. 3 通道低2-70倍。这种作用不同钾通道选择性差、潜在的毒副反应严重成为小分子药物 研发的致病缺点，这主要是有机小分子候选药物作用Kvl. 1-Kvl. 7靶标区域的氨基酸残 基序列几乎完全一致。与有机小分子靶点截然不同的是，多肽作用的靶区域呈现丰富的 序列多样性，这就决定了多肽药物研发是必由之路。在革E向通道Kvl. 3小分子药物研发受阻情况下，国际上把眼光聚焦到钾通道Kvl. 3 特异性动物毒素多肽抑制剂。这类多肽分子内具有3-4对二硫键的结构共性。美国加利 福利亚大学和霍普金斯医院正在联合研发以海葵毒素多肽ShK为分子骨架的先导药物 。 ShK是从海葵中分离到 的3对二硫键的35残基多肽，近两年正通过多肽化学合成方法修饰和合成20多种ShK 多肽的类似物。在2006年，成功地发现了 ShK类似物(ShK-L5)可较好地治疗风湿性关 节炎和I型糖尿病(/WAS; 2006， 103: 17414)，法国国家科学研究中心近年正在以 通道Kvl,3特异性蝎毒素多肽0SK1及A0SK1 LB/oc/re附.丄，2005, 385: 95; Mo/. P/fflWMO /., 2006， 69: 354]为分子骨架，设计和化学合成了 30多种3对二硫键38个残 基类似多肽，加速新型免疫抑制多肽药物研发。同有机小分子相比，靶向钾通道Kvl. 3的先导多肽药物具有极高的特异性。如法国 国家科学研究中心研发的A0SK1的IC50值为3 pM，美国研发ShK多肽IC50值为16 pM, 而目前报道最好的有机小分子先导药物的IC50值为3nM。可见，先导多肽药物比有机 小分子先导药物的特异性提高了 iooo倍。同时，先导多肽药物的选择性也得到了极大 提高。因此，潜在新型免疫抑制多肽药物研发已成为治疗T细胞介导自身免疫性疾病的 新方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种基因工程免疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1。该 多肽分子内具有3对二硫键，在体外具有很强的稳定性，易于长期保存。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种基因工程免疫抑制多肽LWX-1和 LWX-AD-1的制备方法。该方法简单易行，操作方便，易于生产和制备高纯度(色谱 纯)的LWX-1和LWX-AD-1多肽。本专利技术的再一个目的是在于提供了一种基因工程免疫抑制多肽LWX—1和LWX —AD — 1在制备治疗或预防多发性硬化症、I型糖尿病、风湿性关节炎的药物中的应用。 本专利技术还涉及基因工程免疫抑制多肽高特异性结合药物耙标Kvl.3钾通道，不仅可 用于有效地鉴定钾通道Kv1.3，而且可用于诊断和治疗多发性硬化症、I型糖尿病、风 湿性关节炎等T细胞介导的自身免疫力性疾病。钾通道kvl.3已被鉴定为诊断和治疗T细胞介导自身免疫性疾病的靶标，在有机分 子药药研发严重受挫情况下，目前美国、法国、澳大利亚等国家正在研发免疫抑制多肽 药物。本专利技术专利主要目的在于专利技术了具有自主知识产权的蝎毒免疫抑制多肽药物。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施通过生物信息学方法，分子设计了基因工程免疫抑制多肽序列。通过蛋白质结构预 测(http:〃swissmodd.exTOsv.org〃SWISS-MODEL.html) SWISS-MODEL程序和蛋白质结 构分析(http:〃swissmodel.expasy.om/spdbv/) Swiss-Pdb Viewer程序，基于本课题组对蝎 毒多肽与钾通道相互作用多样性及机制的深刻认识，在此基础上，申请人分子设计了免 疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1 。 一种分离的多肽LWX-1 ，其序列为SEQ ID NO: 1所 示的氨基酸序列； 一种分离的多肽LWX-AD-1 ，其序列为SEQIDNO: 2所示的氨基酸 序列。LWX-1: VGI腿CKHSRQCLKPCKDAGMRFGKCTNGKCHCTPK (SEQ ID NO: 1) LWX-AD-1:眼VPTGGCPFSDFFCAKRC画KFGNTGRCTGPNKTVCKCSI (SEQ ID NO: 2) LWX-1和LWX-AD-1多肽分子内具有3对二硫键，具有蝎毒多肽的共性，即结构 性质稳定，易于长期保存。申请人发现LWX-1和LWX-AD-1多肽以干粉形式在4'C下 保存6个月以上，生物活性不变。这初歩稳定性检测也表明了 LWX-1和LWX-AD-1多 肽具有较强的稳定性。一种制备基因工程免疫抑制多肽LWX-1和LWX-AD-1的方法，它包括下列步骤 A、设计引物对于LWX-1多肽，设计4条PCR扩增引物进行2轮PCR扩增获 取 目 的 基 因， 正 向 引 物 为 引 物 PI : 5'GTGAATTCGATGACGATGACAAGGTGGGTATTAATGTGAA3，，弓|物P2 :CTG3'; 反 向 引物为 引 物 P3 :，引物P4: 5'TAGCTCGAGTCACGGGGTACAATGGCATTTGC3'。 对于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多肽，其序列为ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李文鑫，吴英亮，曹志贱，韩松，尹世金，陈宗运，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]