突变型人生长激素和它们的应用制造技术

根据本发明专利技术，提供了对于生长激素显示增强的亲和性，但降低了激素活性的突变型人生长激素，编码它的碱基序列，它们的生产方法以及所述蛋白质的应用。根据本发明专利技术的，对于生长激素受体具有增强的亲和性的蛋白质，可抑制生长激素与其受体的结合，同时它们保持降低了的生长激素活性，从而发现了其作为治疗肢端巨大症和巨人症的药物的用途。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种具有附图说明图1所给氨基酸序列的突变型人生长激素蛋白，一种具有编码所述氨基酸序列的碱基序列的脱氧核苷酸，均具有一定的氨基酸序列的突变型人生长激素蛋白，其中它的氨基酸残基部分被部分置换，插入或缺失至一定程度，但不致使其对生长激素受体显示增强的亲和性以及保持其降低了的生长激素活性的特征性特点丧失，以及涉及它们在制备治疗巨人症和肢端巨大症的药物中的应用。根据本专利技术的无生物活性的人生长激素作为正常生长激素受体的拮抗剂而起作用，从而抑制由于过量分泌而造成的紊乱和过度生长，并且可被用作对巨人症和肢端巨大症的治疗具有改善的安全性的药物。因为由生长激素带来的基因异常，业已知由于生长激素的不足而致使的生长迟缓以及由于过度表达而造成的巨人症和肢端巨大症。对于生长激素不足，已广泛使用补充生长激素的疗法，但是迄今还未开发出对于巨人症和肢端巨大症有效的药物。在1978年，Kowarski等首次报道发现了一种无生物活性的生长激素(一种突变型生长激素)(Kowarski，A.A.等.J.Clin.Endocrinol.Metab.，47461，1978)。然而，至今仍未在分子水平上对突变型生长激素进行说明，虽然已公开报道在来自患侏儒症的小孩的血液中鉴定出一种生长激素的异常多聚体(Valena，L.J.等，N.Engl.J.Med.，312214，1985)。在循环系统的血液中被发现含有无生物活性的生长激素的小孩显示出突变型生长激素的高血液水平，而胰岛素样生长因子(IGF-1)的低血液浓度，从而导致迟缓的生长和发育。但是，该种生长迟缓以对施用的正常生长激素具有良好的反应为特征(Hayek A.等，Pediatr.Res.，12413，1973；Rudman，D.等，N.Engl.J.Med.，305123，1981；Plotnick，L.P.等，Pediatrics 71324，1983；Bright，C.M.等，71576，1983)。在最近一些年里，蛋白质工程和基因工程的发展已使对激素与它们的受体的结合以及它们活性的引发的结构研究成为可能，并由此弄清楚了各种遗传疾病的原因。Cunningham等通过使用蛋白质工程方法制备了大量人生长激素变异体来对生长激素受体的结合位点进行研究，并且因此而鉴定出参与生长激素与其受体结合的区域，该区域形成了由氨基末端(2-19)氨基酸残基，羧基末端(54-74)氨基酸末端和羧基末端(167-191)氨基酸残基组成的区域(Cunningham，B.C.等，Science 2431330，1989)。此外，Uchida等制备了氨基酸残基被经过不同的置换的生长激素变异体，由此测定它们对3T3-F 442A细胞的分化活性，从中得到启发即氨基酸序列62-67区域对于生物活性的发挥具有极其重要的意义(Uchida等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，172352，1990)。最近，对人生长激素与其结合蛋白(受体蛋白质的一部分)的结合方式的结晶学研究得到一个值得注意的发现(De Vos A.M.等，Science 255.306，1992)；其假设生长激素连续地以一种方式与生长激素受体结合，该方式为第一个位置上的生长激素的功能区1与第一个生长激素受体结合，接着生长激素的第二个功能区2与第二个生长激素受体结合，从而形成了生长激素受体的二聚体，于是生长激素的信号被传递至细胞中。其它的感兴趣的是虽然人生长激素的区域1与来自区域2的氨基酸残基不同，但受体蛋白的结合位点表明了共同的氨基酸残基。而且还认识到通过蛋白质工程技术产生的生长激素变异体竞争性地与受体结合(Fuh G.等，Science，2561677，1992)。基因分析的最新进展已使识别导致大量遗传疾病的异常基因成为可能。对于造成侏儒症的生长激素的基因也是这样。由于生长激素发挥它的生理活性是通过细胞膜上的受体来介导的，因此与生长激素相关的基因异常可被粗略地分为两类，即受体基因的异常和生长激素本身的异常。因为生长激素存在于常染色体上，因此它被已知采取隐性遗传的形式。为了让这些异常的表型表达，因此要求亲代的等位基因同时产生异常。过去，已报道多例由于亲代生长激素基因的突变型的复杂组合而产生的生长迟缓，例如全部缺失，部分缺失以及碱基置换。当亲代之一为正常时，已知突变型生长激素存在于细胞内分泌颗粒内部。然而，对于生物体中的错义突变产生的突变型生长激素的分子水平的分析以及其在生物体中将起的作用仍未进行详细的研究。现已知的都不是抑制生长激素过度作用的有效方法。本专利技术人发现具有延迟骨龄的患有侏儒症的5岁男孩显示出生长激素的高血清浓度，并且在诱导试验中保持较低水平的IGF-1，虽然他显示出增高生长激素的血清浓度，这个发现和接下来的另外的进一步研究结果成为了本专利技术。这些内分泌学的发现似乎可能与在生长激素不敏感性综合症中注意到的现象一致(Rosen bloom，A.L.，Acta Pediatr.Scand.(Suppl)，383117，1192)。然而，连续施用生长激素导致了病人的生长的明显提高，这排除了将它诊断为Laron类型综合症的可能，因为Laron类型侏儒症是由于生长激素受体的异常而造成的。本专利技术人使用Nb2生物分析方法发现在患有这类缺陷的小孩中所发现的血清生长激素是一种无活性类型的生长激素，不象正常小孩分泌的那种，并且还通过使用等电聚焦将该激素鉴定为突变型生长激素。发现该突变型生长激素在生长激素的密码子77上用半胱氨酸残基置换了精氨酸残基(R→C)(图1)。置换的位点位于生长激素的第二条α螺旋上，在与受体结合的位点1之后(Cunningham，B.C.等，Science，254821，1991)。被取代的半胱氨酸被认为形成了一个新的二硫键，并使产生的分子改变电荷，并且导致构象改变，从而产生了具有降低了的生长激素活性的突变型生长激素。在生长激素的胞内信号转导中，通过配体结合的生长激素受体的二聚作用以及它们蛋白质中的酪氨酸残基的磷酸化被认为是极其重要的(Argetsinger，L.S.等，Cell，74237，1993Silva，C.M.等，J.Biol Chem.26927532，1994)。生长激素结合蛋白位于胞外功能区，并在体内血清中起生长激素储存器的作用(Herington，A.C.等，Acta Endocrinol(Copenh)，12414，1991)。发现突变型生长激素对生长激素结合受体的亲和性比野生型的大约6倍(图7和8)，这意味着突变型生长激素的功能区1和2显示出对来自野生型的受体的不同的亲和性。突变型生长激素的生物学特征在于通过受体的磷酸化而形成的细胞信号转导活性的明显降低，尽管它对受体蛋白的亲和性大。在给病人连续三天施用野生型生长激素后，没有引起对IGF-1的显著反应，而当在一段延长的时间内施用以起拮抗剂的作用来抑制内源突变型生长激素的分泌以及它与受体的结合时，它被发现在增加IGF-1的血浆浓度和促进生长和发育中起作用。因此，这些发现使得本专利技术人得出结论，即突变型生长激素，当被施用于患有由生长激素过度分泌造成的巨人症和肢端巨大症的病人时，可起拮抗剂的作用以抑制他们的过度生长。在上面新的发现的基础上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有图１所给氨基酸序列的突变型人生长激素蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：千原和夫，
申请(专利权)人：日本化学研究股份有限公司，
类型：发明
国别省市：JP[日本]