新型维管调节因子CsIVP 基因及其在育种中的应用制造技术

本发明专利技术涉及新型维管调节因子CsIVP基因及其在育种中的应用。具体地说，本发明专利技术提供了具有SEQ ID No.1所示序列的编码区的维管调节因子CsIVP基因、具有SEQ ID No.2所示序列的蛋白、所述基因的RNA干扰载体、以及基于所述基因的植物育种方法，所述方法通过干预所述植物中权利要求1所述的基因来进行，还提供了所述基因在植物育种中的应用。基于本发明专利技术所述基因的植物育种方法育种得到的植物具有抗病性尤其是抗霜霉病性提高,以及耐受低氮胁迫等优良性状。

【技术实现步骤摘要】
新型维管调节因子CsIVP基因及其在育种中的应用
本专利技术涉及生物育种领域，尤其涉及维管调节因子CsIVP基因及其在育种中的应用。
技术介绍
在植物进化过程中，维管发育的复杂化对植物高度增加和成功适应陆地环境非常重要。在4.3亿年前，植物维管组织的结构(木质部和韧皮部)由原始维管植物中的简单模式(韧皮部环绕木质部)进化到高等植物的并行维管束(木质部和韧皮部平行排列)。在葫芦科和茄科植物中，维管束内排列为木质部在内外韧皮部中间，这种排列称之为双韧维管束。植物的维管组织从两类分生组织细胞分化而来：原形成层和束间形成层。原形成层在胚胎器官形成时期已经形成，由它产生初生木质部和初生韧皮部。束间形成层最先来源于原形成层细胞或者是其他薄壁细胞，由它产生次生木质部和次生韧皮部。植物维管系统不仅负责运输水分，营养物质和信号分子等成分而且提供机械支撑。木质部主要把根中水分和矿物质运输到茎端，韧皮部将源器官中的光合产物以及各种系统性信号运输到库器官(果实、块茎、根)。木质部由管状分子、薄壁细胞和木纤维细胞组成，韧皮部由筛管分子和伴细胞组成。研究发现维管系统通过运输信号激素，蛋白和小RNA来参与非生物和生物胁迫防御相关过程。然而，至今为止还没有发现维管调节因子参与病虫害或营养胁迫响应。蔬菜是我国重要的经济作物，对国民经济发展具有不可替代的重要作用。黄瓜(CucumissativusL.)作为世界十大蔬菜之一，是我国设施栽培的主要蔬菜种类。实际生产中过量使用化肥和农药不仅造成种植成本增加，而且存在严重的果蔬安全问题和环境问题。黄瓜霜霉病是主要的流行性病害之一。在适宜发病的环境条件下，病害发展迅速，叶片大量干枯死亡。此病在全国各黄瓜产地均有分布，一般年份减产10％至20％，流行年份减产可达50％至70％，重发生田块只能采收1至2次即因病而全部枯死。利用药剂防治是至今为止最主要的治疗方式，但是，化学药剂的使用存在严重的果蔬安全问题和环境问题，也存在霜霉病菌的抗药性问题。氮肥是绝大多数作物需求量最大而土壤供应有限的一种大量元素，然而氮肥过量施用，不仅降低肥料利用率造成了资源浪费，而且破坏土壤生态环境，产生土壤次生盐渍化问题。超量使用化肥使果蔬生长性状低劣，容易腐烂，不宜存放。使用过量的氮肥，会使植物抗病虫害能力减弱，易遭病虫的侵害，继而会增加防虫害的农药用量，直接威胁食品的安全性。因此培育吸收和转运营养物质能力强，尤其是耐低氮胁迫的植物品种例如黄瓜栽培品种具有重要的意义。本专利技术人在黄瓜中分离出了CsIVP基因。CsIVP基因在通过维管发育调节地上部植株形态方面拥有新的功能。CsIVP干扰植株拥有较强的耐低氮胁迫和抵御黄瓜霜霉病的能力，从而解决了氮肥过量施用和霜霉病所导致的问题。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术在第一方面提供了一种维管调节因子CsIVP基因，该基因的编码区具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本专利技术在第二方面提供了一种蛋白，所述蛋白具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或者由权利要求1所述的基因的所述编码区编码。本专利技术在第三方面提供了一种RNA干扰载体，所述RNA干扰载体含有用于干扰权利要求1所述基因的DNA序列。本专利技术在第四方面提供了一种植物育种方法，所述方法通过干预所述植物中权利要求1所述的基因来进行。本专利技术在第五方面提供了本专利技术第一方面所述的基因在植物育种中的应用，其中以所述基因作为靶基因，通过强化或者弱化该基因在植物中的功能来实现所述基因在植物育种中的应用。本专利技术方法以所述CsIVP基因作为靶基因，通过弱化所述基因在植物体内的作用，使得培育出的植物具有有益性状。(1)叶片表皮细胞角质层厚度增加，叶片向下弯曲生长。由于角质层覆盖在植株表皮上，能抵御病原菌的侵袭和病虫害的侵害，而且还能减少水分蒸发损失。另外，叶片向下弯曲生长，使得在下雨或者浇水时不在叶片上长时间残留水滴，这又进一步减少病原体的侵袭风险。因此，弱化或者消除该基因的功能，可以提高植株的抗病性，尤其是抗例如霜霉病的能力增强，这在例如黄瓜上特别的重要，因为霜霉病是主要的流行性病害之一，在适宜发病的环境条件下，病害发展迅速，叶片大量干枯死亡。此病在全国各黄瓜产地均有分布，一般年份减产10％～20％，流行年份减产可达50％～70％，重发生霜霉病的田块只能采收1～2次即因病而全部枯死。利用药剂防治是至今为止最主要的治疗方式，但是，化学药剂的使用存在严重的果蔬安全问题和环境问题，也存在霜霉病菌的抗药性问题。抗霜霉病材料的发掘能高效减少化学药剂的使用，减轻对人类和植物生存环境造成的危害，降低种植成本，并能够保证可食用果蔬的安全。(2)茎变粗，茎维管束数量增加。如此增强了维管束的运输能力，有利于根部吸收的营养物质和水分有效地运输到叶片等地上部器官。(3)耐受低氮胁迫。这可能也与运输能力的增强有关。植株耐受低氮胁迫是一种非常重要的性能，因为氮肥是绝大多数作物需求量最大而土壤供应有限的一种大量元素，而且是农业生产中增产增收的一大助力。尤其在设施蔬菜栽培过程中，氮肥的投入对作物产量增加作用明显。但是，超量使用化肥使果蔬生长性状低劣，并且容易腐烂，不宜存放。使用过量的氮肥，会使植物抗病虫害能力减弱，易遭病虫的侵袭，继而会增加防虫害的农药用量，直接威胁食品的安全性。因此，耐低氮品种的选育能够降低菜农施用化肥的种植成本，减轻了化肥和农药对土壤环境和食品安全的影响。(4)节间变短，株型变矮。黄瓜为无限生长型，在例如温室栽培时需要人工落蔓。节间变短，植株矮小利于温室栽培，落蔓次数减少，省工省力。(5)雄花花冠变小，开放受影响，进而花粉的产生和散发受到影响，花粉活力降低。以黄瓜为例，商品黄瓜是单性结实，没有种子的黄瓜在市场上受欢迎，花粉活力降低使黄瓜风媒传粉和虫媒传粉的成功率降低，黄瓜雌花授粉率低，利于单性结实，生产受欢迎的无种子的商品黄瓜。附图说明图1是本专利技术在黄瓜中克隆到的CsIVP与拟南芥中的同源基因的序列比对图，由比对结果可以看出，CsIVP基因与其他基因的序列显著不同，是一个新基因。图2显示了黄瓜CsIVP基因结构和表达分析结果。(A)黄瓜CsIVP基因结构分析。深灰色长方形代表外显子，黑线代表内含子，浅灰色长方形代表bHLH结构域位置。(B-F)原位杂交分析CsIVP在果实中的表达模式。CsIVP在果实维管束的木质部(C)和珠柄(D)特异性表达。(E-F)正义探针无信号，作为负对照。(G)CsIVP定位在洋葱表皮细胞细胞核中，说明CsIVP是一个转录因子。35S:GFP作为对照组。图3显示了CsIVP-RNAi转基因植株表型分析结果。(A-B)和野生型(WT)植株(A)相比，CsIVP-RNAi转基因代表株系R5，R3，R2植株(B)形态相对矮小。(C)荧光定量PCR证明CsIVP在CsIVP-RNAi转基因株系中RNA水平表达下降。(D-F)CsIVP-RNAi转基因代表株系植株变矮，茎变粗。(D)中括号形线条代表野生型和CsIVP-RNAi转基因植株第二节位茎。(E-F)植株高度(E)和茎粗(F)数据统计结果。WAG代表发芽之后的周数。(G-I)叶片(G)和开花当天的雄花(I)表型。中间一排中的白色三角号代表释放的花粉，最下面一排被染本文档来自技高网...

【技术保护点】
维管调节因子CsIVP基因，其特征在于，该基因的编码区具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.维管调节因子CsIVP基因，其特征在于，该基因的编码区具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或者由权利要求1所述的基因的所述编码区编码。3.一种RNA干扰载体，其特征在于，所述RNA干扰载体含有用于干扰权利要求1所述基因的DNA序列。4.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法通过干预所述植物中权利要求1所述的基因来进行；优选的是，所述干预为阻断或者抑制。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)构建以权利要求1所述基因作为靶基因的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到植物中；和(3)筛选获得阳性转基因植物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)的RNA干扰载体通过如下方式构建：在所述编码区中选取200至500bp特异性片段设计18至25bp的引物，然后将该200至500bp片段正反向插入到质粒载体中，得到所述RNA干扰载体；和/或步骤(2)中的转化通过如下方式进行：利用电击法将RNA干扰载体转到农杆菌中，利用农杆菌转染植物外植体，经过不定芽分化培养、生根培养，最后得到所述转基因植物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述外植体为子叶，并且通过如下方式获得：将植物的种子用水浸泡3小时后剥去外种皮，使用75％乙醇中清洗30秒，用无菌水冲洗2次，再用3％的NaClO水溶液清...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小兰，颜爽爽，宁康，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11