生长抑素卵黄抗体及其制备制造技术

本发明专利技术涉及生长抑素卵黄抗体及其制备方法。本发明专利技术合成了生长抑素（ＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎＳＳ）与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的人工抗原（ＳＳ－ＢＳＡ），作为免疫原，并将该人工抗原用于免疫ＳＰＦ产蛋鸡，获取了可促进动物生长的生长抑素卵黄抗体。使用本发明专利技术的卵黄抗体免疫鸡只，试验组动物的平均体重比对照组高１４％，试验组动物的料肉比也极显著高于对照组，试验组饲料消耗亦显著低于对照组。说明生长抑素卵黄抗体不仅具有明显的促生长作用，且能够节约饲料。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生长抑素的一种抗体及其制备方法。生长抑素(Somatostatin，以下简称为SS)是一种广泛存在于动物机体各组织器官的重要激素，它具有多种生物功能，如抑制生长激素(GH)，促甲状腺素，胃肠胰岛激素等的分泌；抑制神经垂体激素的释放；抑制胃的分泌及调整胃肠循环和运动和营养物质的吸收等。由于SS在动物体内可抑制生长激素的释放，因此，消除或减低SS的抑制作用，可提高生长激素在体内的释放水平，促进动物生长发育。国内外均有人运用SS免疫中和技术进行过此方面的研究。如用SS主动免疫牛、羊，猪等动物，使动物体内的SS水平下降，GH水平提高，增加动物体重(Spencer G.S.G.et al.，1983，Livestock Prod.Sci.，10469-473；黄先夺，姚连生等，1991，江苏农业科学，(4)53-54)；黄先夺，姚连生等，1991，江苏农业学报，7(4)37-40)。这种免疫方式的缺点是产生的免疫反应低下，尤其在免疫后最初1-2月内，增重效果不明显，甚至体重有所下降，这就限制了主动免疫的应用。还有人用SS制备的抗血清和单克隆抗体经处理后被动免疫大鼠，以提高体重(Maccicchini M.L.，1986，US Patent.4,599,299 Jul.8)。被动免疫虽能克服免疫反应低下的问题，但是抗血清的来源受限，还有可能存在过敏反应等问题。有人用基因工程方法研制了可表达SS的基因工程亚单位苗，用来免疫大鼠，促进生长。但此方法的主要缺点仍为免疫原性较差(徐文忠，杜念兴等，1993，中国科学，23(12)1272-1278)本专利技术的目的是研制一种SS抗体，该抗体促进动物生长的效果好，不易发生过敏，该抗体的制备具有来源丰富、产量高、对环境无害等优点。由于生长抑素的分子量很小，本身不具有免疫原性，属半抗原。需要与大的载体蛋白通过化学方法进行联接，构成新的具有SS免疫原性的人工抗原。生长抑素卵黄抗体制备技术的关键在于载体蛋白及免疫程序的筛选。两者的选择决定了抗体的效价水平。本专利技术合成了生长抑素(Somatostatin SS)与牛血清白蛋白(Bovine Serum AlbuminBSA)的人工抗原(SS-BSA)，作为免疫原，并将该人工抗原用于免疫SPF产蛋鸡，获取了可促进动物生长的生长抑素卵黄抗体。一.人工抗原的制备1.反应原理N-乙基，N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(N-ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，简称为EDC)作为缩合剂，可使氨基和羧基间脱水缩合而形成酰胺键。在一定的反应条件下，载体蛋白质或半抗原分子上的羧基先与碳化二亚胺反应，生成中间产物，再与另一个载体蛋白或半抗原分子的氨基反应，形成偶联物，即人工抗原。2.制备方法化学联接根据SS与BSA的分子结构、两者的氨基和羧基的比例及其分子量之比，计算出在同一联接体系中，SS与载体蛋白BSA的投放比例。将SS溶于PBS缓冲剂中，溶解后加入BSA，再加入缩合剂EDC；反应结束后，通过透析法去除系统中未联接上载体蛋白的半抗原，交联剂等小分子，(透析虽不能除去BSA等大分子，但由于检测抗原选用其他载体蛋白可避免BSA对抗体检测的干扰，故无需对反应体系中的BSA做处理)，即得到所需的人工抗原-SS-BSA。3.抗原的检测使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法检测联接反应产物人工抗原的联接效果。取载体蛋白BSA作为对照，进行电泳，由于SS-BSA比BSA分子量略大，结果显示样品的条带比BSA的位置略有后移。二.卵黄抗体的制备1.动物免疫(1)免疫准备取上述联接反应产物SS-BSA人工抗原，加入福氏完全佐剂，充分乳化备用；或取上述SS人工抗原，加入福氏不完全佐剂，充分乳化备用。(2)免疫取产蛋鸡数只，用SS-BSA人工抗原进行免疫，另设不进行免疫的空白对照组，常规饲养。免疫程序为初次免疫时每只鸡胸肌多点注射抗原，两周后进行二免(与初免注射量相同)，相隔两周进行加强免疫(注射量加倍)，再隔两周后进行第四次免疫(注射量再加倍)。2.卵黄液制备四免后一周开始收集各实验组鸡所产的鸡蛋，制备成卵黄液以进行下步测定抗体效价。3.抗体检测在SS-BSA人工抗原中SS相当于一个抗原决定簇，检测抗原SS-CWS除SS部分与SS-BSA相同外，其余皆不同。这表明若本次试验所得卵黄液和SS-CWS产生抗原抗体反应即说明卵黄液中含有针对于SS的抗体，其抗体效价为针对SS的抗体效价。相对于SS-BSA免疫组分别用SS-BSA，SS-CWS，BSA，CWS(chicken whole serum鸡全血清简称CWS)，EDC作为检测抗原。结果见表1表1不同抗原检测结果 卵黄液和SS-BSA及SS-CWS反应皆呈阳性结果，而SS-BSA和SS-CWS两者相同抗原成分为SS，这说明是卵黄液中具有SS的特异性抗体结构。由于纯化人工抗原时未去除BSA，故卵黄液中含有BSA的抗体。4.抗体效价检测用琼脂扩散法进行抗体效价的检测。方法使用常规方法制备琼脂凝胶，使用鸡全血清(CWS Chicken Whole Serum无菌采取SPF鸡全血后10000rpm离心3分钟去血细胞，由中国兽医药品监察所实验动物室提供。0.2μm滤膜除菌及杂质)作为载体蛋白，用前述与连接SS和BSA相同的方法制成检测抗原SS-CWS。将卵黄抗体等量梯度稀释和SS-CWS反应，有反应的抗体最大稀释度即为抗体效价。本方法检测生长抑素卵黄抗体的效价为1∶32。三.SS卵黄抗体促生长试验及结果使用SS-BSA卵黄抗体免疫鸡只，7日龄首次免疫，每只鸡颈部皮下注射1ml，以后每10天免疫一次，药量相同，共免疫6次，结果两次免疫后，试验组的平均体重即极显著地高于对照组，试验结束时试验组的平均体重比对照组高14％；另外试验组的料肉比也极显著高于对照组，并保持显著差异至试验结束。这说明SS卵黄抗体具有明显的促生长作用。实施例1生长抑素与牛血清白蛋白人工抗原(SS-BSA)的制备材料与方法1.生长抑素Somatostatin-14(SS)，其氨基酸序列为丙-甘-半胱-赖-天冬-苯丙-苯丙-色-赖-苏-苯丙-苏-苯丙-苏---丝-半胱 分子量1637.9分子式C76H104N18O19S2纯度≥98％购自晶美生物工程有限公司。2.牛血清白蛋白组分V(BSA Bovine Serum Albumin Fraction V)，进口分装，分子量≥60000购自北方同正生物有限公司。3.N-乙基，N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)。分子式Cl-购自北京华美生物有限公司。4.缓冲液PBS在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl，0.2g KCl，1.44gNaHPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节PH值至7.2，加水定容至1L，15Ibf/in2高压灭菌20分钟，室温保存。5.化学联接SS与BSA按1∶10(M∶M)的比例投放，即取1.5mg溶于5ml PBS中(PH7.2)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工抗原，其特征是该抗原是生长抑素与牛血清白蛋白在Ｎ－乙基，Ｎ′－（３－二甲氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐的作用下，缩合而成的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨兵，王金洛，秦泽荣，宋维平，赖平安，
申请(专利权)人：北京市农林科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]