人绒毛膜促性腺激素的纯化方法技术

一种从中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞上清液的原重组人绒毛膜促性腺激素（ｈＣＧ）样本纯化重组人绒毛膜促性腺激素的方法，其包括联合使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。用离子交换色谱法洗脱两次，最后用粒度排斥色谱法使人绒毛膜促性腺激素纯化至完全不含任何污染物。由这种方法可制成高纯人绒毛膜促性腺激素，其比生物活度非常高，约为２５．０００ＩＵ／ｍｇ。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种绒毛膜促性腺激素(CG)的纯化方法，具体地说，涉及从原始重组人绒毛膜促性腺激素样本纯化重组人绒毛膜促性腺激素的方法。该方法包括使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。这种激素是一种由以非共价键结合的α和β亚基组成的异二聚物。它主要影响促性腺激素中的黄体生成激素。在治疗由于没有促性腺激素或促性腺激素浓度过低而导致无排卵性不孕症时，可给妇女施用绒毛膜促性腺激素诱导以促卵泡激素或人体绝经期促性腺激素刺激卵泡的发育后排卵。通过肌肉注射施以5000至10000单位一次剂量以仿真正常刺激排卵的黄体生成激素的半峰值。对于体外受精作业以及其它包括超排卵和卵母细胞收集的助孕技术，也会将绒毛膜促性腺激素和月经激素一起施用，有时还加上辅助剂枸橼酸氯芪酚胺。绒毛膜促性腺激素业已用于治疗男性青春前期的隐睾病。服用的方法有多种，但通常每周进行三次肌肉注射，每次的剂量从500至4000单位。绒毛膜促性腺激素也用于治疗男性因促性腺激素不足性腺机能减退而导致不育的疾病。另外，服用的剂量也很不同，每周二次或三次，每次的剂量从500至4000单位。而且往往会加入一种具有促卵泡活性的药剂，如月经激素以产生正常精子。对于精子减少，每周可施以高达3000单位剂量的绒毛膜促性腺激素，配以月经激素或另一种促卵泡制剂。在治疗男性与性腺机能减退相关的滞后青春期时，每周施用二次500至1500单位的剂量；将剂量对血浆睾血激素浓度进行滴定。目前，从原尿液样本分离和纯化人绒毛膜促性腺激素可采用各种不同的方法。最近，有人业已研究出一种亲合色谱法，也称膜过滤亲合色谱法，用于从尿液纯化人绒毛膜促性腺激素。这种方法不用溴化氰激活亲合色谱柱中的琼脂糖固相，这代表以亲合色谱法从尿液样本纯化人绒毛膜促性腺激素的常规方法的一种改进。根据该方法纯化的人绒毛膜促性腺激素的免疫活性为8554IU/mg。重组人绒毛膜促性腺激素的优点是不含有其它促性腺激素和来源于人体的污染物，特别是人体尿液中的污染物。但是，重组人绒毛膜促性腺激素的原制剂含有其重组生产中所用的细胞中的所有其它蛋白质及污染物，因此迫切需要一种能使重组绒毛膜促性腺激素完全纯化的方法。纯化过程是以离子交换色谱法和反相高效液相色谱法为基础进行的。可进一步使用粒度排斥色谱柱使残留污染物完全除去。用离子交换色谱法至少洗脱两次所得的结果为最好。本专利技术的方法可以用于纯化从重组后得到的培养基原制剂的重组人绒毛膜促性腺激素。所得的重组人绒毛膜促性腺激素的纯度和比生物活度(比生物活度在23.000和28.000IU/mg之间)非常高，基本上不含在培养基中常有的胎牛血清蛋白质、供重组过程用的宿主细胞所含有的核酸或其它污染物。本专利技术的方法也可用于纯化孕妇尿液原浓缩液中的尿液人绒毛膜促性腺激素，以及纯化其它哺乳动物的绒毛膜促性腺激素，例如，牛、马、猪、羊、和猴。本专利技术的目的在于提供一种将样本的人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，其包括使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。该方法包括以下步骤用离子交换色谱法使样本洗脱，再用反相高效液相色谱法使洗脱液洗脱。以及一进一步的步骤是使洗脱液通过粒度排斥色谱柱。为了得到最好的纯化结果，在不同条件下优选用离子交换色谱法洗脱两次。本专利技术方法的优选实施例包括如下步骤(a)样本用硅胶色谱柱洗脱；(b)用二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖离子交换色谱柱洗脱；(c)用羧甲基(CM)琼脂糖离子交换色谱柱洗脱；(d)用硅胶C18反相高效液相色谱柱洗脱；以及(e)用Sepharcyl粒度排斥色谱柱洗脱。在本专利技术的优选实施例中，用二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖离子交换色谱柱洗脱时采用pH值约等于7.5的磷酸钠缓冲液。用CM琼脂糖离子交换色谱柱洗脱时优选采用pH值约等于6的磷酸钠缓冲液。反相高效液相色谱柱步骤(d)优选以异丙醇/三磷酸盐缓冲液作为流动相。本专利技术的绒毛膜促性腺激素优选是人绒毛膜促性腺激素，最好是重组人绒毛膜促性腺激素，其由重组过程用的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的培养基衍生。本专利技术的另一个目的在于提供一种药物组合物，它包括一由上述重组过程制备的有效治疗量的纯重组人绒毛膜促性腺激素，以及适当赋形剂。其中一种适当赋形剂是有助冻干产品稳定的蔗糖。重组人绒毛膜促性腺激素的药物组合物特别适合在皮下施用。本专利技术使用生物原料，特别是含有人绒毛膜促性腺激素和其它污染蛋白质的混合物，本文称之原料样本。下面详细叙述的实施例均采用含有重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)的原料样本，其由一生物反应器的细胞上清液培养基制成。另一个样本是孕妇的原浓缩尿液。样本是新鲜采集并在生物反应器灌流超过二天的细胞上清液培养基。最好将上清液过滤澄清。若需要，浓缩原溶液，并用C4硅胶色谱法洗脱以去除来自细胞培养基中的污染物。然后，用离子交换色谱法洗脱过滤后的半纯化收集液，优选在不同条件下洗脱两次，再用反相高效液相色谱柱洗脱。第一次离子交换步骤优选采用二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖，这是人绒毛膜促性腺激素”直通”必需步骤，该步骤可除去大部分非人绒毛膜促性腺激素蛋白质和脱氧核糖核酸(DNA)。第二次离子交换步骤优选采用CM琼脂糖柱，这是人绒毛膜促性腺激素的”结合”步骤，用于除去残留的DNA和宿主细胞或培养基蛋白质污染物。在一优选实施例中，该步骤是以pH值为6的磷酸钠缓冲液在5℃下进行洗脱。硅胶C18反相高效液相色谱法可有效除去残留的核酸和由细胞培养基衍生的污染物。色谱柱优选以异丙醇/三磷酸盐缓冲液作为流动相。存留液优选在截留分子量为10KD的滤膜上进行超滤，然后浓缩，并用pH值等于8的碳酸氢铵回收。浓缩的产品再用Sephacryl S200 HR粒度排斥色谱柱洗脱。在该步骤中，用pH值等于8的碳酸氢铵洗脱，按分子大小进行分离以除去仍可能存在的微量由细胞培养基衍生的污染物、潜在的原子团和游离的人绒毛膜促性腺激素亚基。然后，洗脱液要经透析，最好在pH值等于7的磷酸钠缓冲液中用截留分子量为10KD的滤膜进行超滤。过滤后的纯人绒毛膜促性腺激素本体溶液最好低温冷藏于消毒瓶中。下面的流程简图(表1)是重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)纯化过程的一优选实施例，简要列出色谱柱树脂和中间各步骤操作的要点。表1重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)纯化过程的流程简图 下面详细叙述流程图和纯化过程。收集步骤(步骤1)的条件就是当原料是重组来源时正常所采用的条件。第一步收集步骤在这一步(步骤1)中，先要进行初步浓缩，并把缓冲液变成可控制组分。该步骤要先在室温下进行(硅胶C4色谱法)，然后降至约5℃。优选温度范围是5±3℃。在生物反应器生产周期的过程中各收集液重复步骤1。(i)收集液的澄清先将从生物反应器新鲜收集的培养基过滤澄清。(ii)硅胶C4色谱法把澄清的收集液装入预先用0.025M pH7的磷酸钠溶液平衡过的硅胶C4色谱柱。优选pH值范围是在6.6和7.7之间。用0.025M的磷酸钠溶液清洗色谱柱，直至紫外线显示器的信号回到基线。然后用含有34.2％(重量)异丙醇的0.025M的磷酸钠溶液对产品进行洗脱。(iii)氨处理把氨加入溶液中直至最后浓度达到1M。该混合物培养6小时。然后用2倍水稀释，并用85％的磷酸将pH值调至7.5。优选pH值范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从样本纯化人绒毛膜促性腺激素（ｈＣＧ）的方法，其特征在于：所述方法包括使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G帕拉迪斯，M罗西，L斯卡利亚，
申请(专利权)人：雪兰诺实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]