含有MCMV IE2启动子的表达载体制造技术

本发明专利技术涉及含有ｍＣＭＶ－ＩＥ２基因启动子或其功能性表达启动片段，和／或ｍＣＭＶ－ＩＥ２基因增强子或其功能性表达增强片段的表达载体，其中该表达载体不含有任何全ｍＣＭＶ基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及含有mCMV-IE2基因启动子或其功能性表达启动片段，和/或mCMV-IE2基因增强子或其功能性表达增强片段的表达载体，其中该表达载体不含有任何全mCMV基因，本专利技术还涉及含有这些载体的宿主细胞，利用这些表达载体产生所希望的多肽的方法，以及所述表达载体的用途。含有mCMVIE2启动子和mCMVIEl启动子，任选地还有新颖的mCMVIE2增强子的表达载体是本专利技术的优选实施例，特别是当该两个启动子以双向设置时。
技术介绍
数十年来，表达载体被用作表达编码宿主细胞内感兴趣多肽或蛋白质的基因或cDNA的媒介。一直以来，人们将重组DNA瞬时或稳定转染到宿主细胞内，以此方式用强的病毒或细胞启动子和增强子来高水平表达感兴趣的基因。在这一方面，人巨细胞病毒的即刻早期(immediate early，IE)区特别适用，已经知道，例如从EP0323997B1可知，由该区可产生含有基因元件的表达载体。直至今天，使用小鼠巨细胞病毒(mCMV)的基因调控序列的情况还是不多，虽然mCMV产生的调控序列已被鉴定为极其有效，甚至比人对应物具有更强的作用(Kim等人，2002)。美国专利US 4,963,481(de Villiers)公开了一些表达载体，其DNA在mCMV IE基因区产生的DNA片段(包括自病毒性基因组分离出来的约2270个碱基对(bp)限制性内切核酸酶PstI片段)转录控制下编码异源蛋白质。此片段的1387bp截短型作为表达异源蛋白质的启动子能明显提高DNA片段的效率。美国专利US 4,968,615(Kozinowski)描述了一些重组DNA分子，它们含有小鼠巨细胞病毒(MCMV)的转录增强子，可用来增强真核细胞结构基因的转录。据de Villiers(US 4,963,481)鉴定，mCMV增强子位于2.27kb PstI片段内。Manning和Mocarski(1988)分析了mCMV IE2区对小鼠巨细胞病毒复制的重要功能。为此，构建了一个重组病毒，它带有受mCMV IE增强子/启动子转录控制的lacZ报导基因，因而破坏IE2基因。事实上，观察不到任何IE2基因表达，病毒正常地复制。作者由此得出这样的结论IE2基因不存在于诸如mCMV和hCMV等巨细胞病毒中，而且不是病毒复制的必要条件。Manning和Mocarski没有公开或提示到IE2增强子/启动子区的任何特定用途。最近一些文章表明，小鼠与人CMV IE区之间还有不同之处。小鼠基因座以与第一IE基因相反的方向表达第二主要mRNA。该第二即刻早期基因被称为IE2，它的启动子序列称为IE2启动子(Messerle等人，1991)。迄今为止，还未曾有人在载体中使用mCMV的IE2区表达异源蛋白质。
技术实现思路
本专利技术基于这样的发现含有带mCMV IE2启动子区的DNA元件的载体能有效地驱动转染宿主细胞内感兴趣基因的表达。本专利技术还基于mCMV IE2区内一个新增强子的鉴定，该增强子在此处被称为mCMV IE2增强子。这个增强子满足通常关于增强子定义的标准，即独立于(1)位置，(2)方向增加表达，以及(3)增加由异源启动子驱动的表达。所以，本专利技术第一方面涉及一种表达载体，它含有mCMV-IE2基因启动子或其功能性表达启动片段，和/或mCMV-IE2基因增强子或其功能性表达增强片段，其中该表达载体不含有任何全mCMV基因。本专利技术第二方面涉及一种含有本专利技术载体的宿主细胞。本专利技术第三方面涉及一种生产感兴趣多肽的方法，该方法包括用本专利技术载体转染宿主细胞的步骤。本专利技术第四方面涉及一种生产感兴趣多肽的方法，该方法包括培养本专利技术宿主细胞的步骤。本专利技术第五方面涉及本专利技术载体在表达一或多个感兴趣基因或cDNA中的用途。本专利技术第六方面涉及本专利技术载体在选择表达高含量感兴趣基因的克隆中的用途。本专利技术第七方面涉及本专利技术载体在DNA疗法中的用途。附图说明图1所示为用在表达构建体中自mCMV IE区产生的双向DNA元件序列。图中分别示出IE2和IE1启动子的+1位点和TATA盒。框内为两种基因的核心启动子。HpaI和XhoI限制位点以粗体表示。给出的-682位置以IE1的+1为基准。图2所示为报导基因构建体A至G。萤光素酶报导基因以粗线表示，启动子以空心箭头表示。A阴性无启动子对照(pGL3基本型)。BSV40启动子/增强子驱动的萤光素酶报导基因载体(pGL3对照)。C萤光素酶表达，IE1启动子驱动(pmCMV萤光素酶，IE1驱动)。D萤光素酶表达，IE2启动子驱动(prevmCMV萤光素酶，IE2驱动)。E萤光素酶表达，IE2启动子驱动，IE1启动子缺失(prevmCMV萤光素酶(ΔXhoI)，IE2驱动，IE1缺失)。F萤光素酶表达，IE1启动子驱动，IE2启动子缺失(pBS.MCMV3萤光素酶，IE1驱动(1.4kb)，IE2缺失)。G萤光素酶表达，IE1启动子短型驱动(p-680萤光素酶，IE1驱动(短型，0.68kb))。图3所示为一个类似图2中构建体C(构建体C-2)的双向构建体，具有与IE2启动子连接的IL-18BP编码序列(粗线)。所以，此构建体内mCMV IE1启动子驱动萤光素酶表达，同时mCMV IE2启动子驱动IL-18BP表达。三角形内含子。闭合椭圆形polyA。图4所示为图2中不同报导基因构建体A至G的萤光素酶报导基因表达。用构建体A至G瞬时转染，或者模拟转染无血清培养基(SFM)中生长的CHO-S细胞。萤光素酶活性以RLU＝相对光亮度单位表示。图5所示为在转染CHO-S细胞稳定池中测到的萤光素酶表达，以RLU表示。所述细胞与图2所示的构建体D、C、F和E转染后在SFM中培养。选择21天后评价萤光素酶表达。图6所示为细胞用900、500、300和100ng图3所示的双向构建体C-2转染后测到的萤光素酶表达，以RLU表示。图7所示为根据图6的瞬时转染实验(构建体C-2)得到的细胞培养上清液中IL-18BP的数量(ng/1)。图8所示为根据图6和图7的实验测到的IL-18BP与萤光素酶之数量比。图9所示为48个克隆表达的萤光素酶数量(以RLU计，左边y轴)和IL-18BP数量(单位为ng/ml，右边y轴)，所述克隆是用双向构建体C-2(如图3所示)转染后8天被挑选出来。萤光素酶的检测极限约500RLU，IL-18BP的检测极限为2.5ng/ml。X轴上每一个增量表示一个克隆。图10(a)所示为报导基因构建体H至N。萤光素酶报导基因(Luc)以粗线表示，IE1和IE2启动子以空心箭头表示。增强子以灰色椭圆形表示浅灰色表示已知的IE1增强子，深灰色表示新的IE2增强子。H带IE2启动子的双向构建体驱动的萤光素酶表达；IIE2启动子驱动的萤光素酶表达，IE1启动子缺失；J、K、L、M、N含有截短mCMV启动子的构建体，图中的位置对应于mCMV启动子的碱基对数目，以IE2的+1位为基准点。J相距-1076K相距-783L相距-587M相距-387N相距-189。图10(b)所示为在无血清培养基中生长的CHO-S细胞瞬时转染后，图10(a)所示报导基因构建体H至N的萤光素酶表达(以RLU计)。图11(a)所示为结合了新IE2增强子(灰色椭圆形)与SV40启本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达载体，其特征在于：所述载体含有ｍＣＭＶ－ＩＥ２基因启动子或其功能性表达启动片段，和／或ｍＣＭＶ－ＩＥ２基因增强子或其功能性表达增强片段，其中该表达载体不含有任何全ｍＣＭＶ基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P沙特拉德，M伊姆霍夫，
申请(专利权)人：雪兰诺实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]