一种用于阿胶及其复方制剂真伪鉴定的组合物、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于阿胶及其复方制剂中的阿胶真伪鉴定的组合物、试剂盒及其检测方法，所述组合物由多肽I、多肽II、多肽III以及对照品检测基质组成，通过利用该组合物检测阿胶及其复方制剂中驴皮源成分含量，从而判断阿胶真伪。所述多肽I的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，多肽II的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，多肽III的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，对照品检测基质为鱼皮胶。通过多肽I的检测值减去多肽II的检测值，并利用多肽III的检测值来修正检测偏差，从而实现对阿胶及其复方制剂中驴皮源成分的含量检测。该方法具有含量检测准确、操作简单的优点，在阿胶产品质量监控领域将具有广泛的应用前景。

Composition, reagent kit and detection method for genuineness identification of donkey hide gelatin and its compound preparation

The invention discloses a composition for identification of gelatin donkeyhide glue and its compound preparation of the reagent kit and detection method of the composition by the peptide I and peptide II and peptide III and control test matrix composition, through the use of the composition of donkey hide gelatin detection source and its compound composition and content, so as to judge donkeyhide glue. The amino acid sequence of I polypeptides SEQ ID NO.1 shows, the amino acid sequence of polypeptide II SEQ ID NO.2 shows, the amino acid sequence of polypeptide III SEQ ID NO.3 shows, control test matrix for fish glue. The detection value of the polypeptide II is subtracted from the detection value of the polypeptide I, and the detection deviation is corrected by the detection value of the polypeptide III, so as to realize the content detection of the donkey skin ingredient in the donkey hide gelatin and the compound preparation thereof. The method has the advantages of accurate content detection and simple operation, and has wide application prospect in the field of quality control of ejiao.

【技术实现步骤摘要】
一种用于阿胶及其复方制剂真伪鉴定的组合物、试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种鉴定阿胶及其复方制剂真伪的组合物、试剂盒及其检测方法。本专利技术属于医药检测

技术介绍
阿胶作为一种传统名贵中药，已有数千年的食用历史，具有补血滋阴，润燥，止血的功效。中国药典规定，阿胶为马科动物驴EquusasinusL.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。纯正的阿胶必需来自百分百的驴皮，方能保证产品的功效。从原料生物分类学上看，驴属于奇蹄目马科驴属，包括非洲野驴、藏野驴、中亚野驴、家驴等品种。其中中国饲养的家驴包括关中驴、德州驴、广灵驴、佳米驴、泌阳驴、淮阳驴、庆阳驴、华北驴、新疆驴、西南驴等众多地方品种。由于驴的畜牧价值不断下降，而其经济价值却未见提高，驴的数量在世界范围内急剧下降，驴皮的供应也逐年紧张，价格不断上涨。市场上出现了很多不法分子，在生产阿胶时，部分甚至全部用各种其他动物皮包括马皮、骡皮、牛皮、猪皮等来取代驴皮进行熬制，有的甚至直接掺入工业明胶。阿胶的复方制剂中往往以阿胶为主要功效成分，如果在生产阿胶的复方制剂中加入的是低廉的伪品阿胶，其药效可想而知。总之，这些伪品的存在不但损害了消费者利益，而且严重干扰了市场正常秩序，影响了正规产品的信誉。阿胶经长时间高温蒸煮浓缩而成，主要成分非常相近且不同厂家的生产工艺存有差异，采用红外、近红外、X-衍射、HPLC等方法对阿胶进行真伪鉴别常存在判断不准确、缺乏足够说服力等。目前已报道的鉴别阿胶真伪比较权威的方法主要是DNA分子鉴定方法和检测特征性肽段的液质联用方法。已报道的这两种方法都无法对阿胶中驴皮源成分进行比较准确的定量检测，而是通过检测阿胶中是否含有驴的成分，并排除其他动物源成分来判断阿胶真伪；但阿胶的掺假可能会五花八门，因此需要排除的动物源成分会是多种多样，利用排除法来鉴别阿胶真伪存在重要缺陷，其准确性和可靠性会大打折扣，这种情况非常不利于对市场阿胶产品的监管。利用驴皮源成分含量来判断阿胶真伪，可从根本上限制阿胶的造假行为。已报道的文献中，对驴皮源性成分检测，基本都没有排除马皮源性成分，因此虽宣称为驴皮源成分，实则为驴与马共有。因此，目前迫切需要提出一种能够快速、准确检测阿胶及其复方制剂中阿胶含量的方法，进而实现对阿胶产品的真伪鉴别。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定阿胶及其复方制剂真伪的组合物。本专利技术的另一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定阿胶及其复方制剂真伪的试剂盒。本专利技术的再一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定阿胶及其复方制剂真伪的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术的一种用于阿胶及其复方制剂真伪鉴定的组合物，所述组合物由多肽I、多肽II、多肽III以及对照品检测基质组成，其中：所述多肽I的氨基酸序列为Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ala-Gly-Glu-Lys(SEQIDNO.1)，多肽II的氨基酸序列为Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg(SEQIDNO.2)，多肽III的氨基酸序列为Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg(SEQIDNO.3)，对照品检测基质为鱼皮胶。含有所述组合物的检测试剂盒也在本专利技术的保护范围之内。进一步的，本专利技术还提出了一种阿胶及其复方制剂真伪鉴定的方法，包括如下步骤：1)对照品溶液的制备：称取对照品检测基质于量瓶中，加入NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，加入称量好的多肽I、多肽II和多肽III，完全溶解，摇匀,微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；2)待检测样品溶液的制备：取待测样品，重量记为N1，加水溶解后，加入三氯乙酸溶液，超声，离心后去除上清液，沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重，重量记为N2；称取一定量沉淀干燥物于量瓶中，加入NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，续滤液中加入胰蛋白酶溶液，酶解；3)液质联用仪检测分别取对照品溶液、待检测样品溶液放入液质联用仪进行检测；选择m/z725.3→962.5、818.4，m/z386.4→499.3、643.3，m/z444.0→331.2、613.3作为检测离子对进行MRM扫描，其中选择m/z725.3→962.5、m/z386.4→499.3、m/z444.0→331.2分别作为多肽I、多肽II和多肽III的定量离子对进行定量检测；4)样品中驴皮源成分含量的计算以对照品溶液的各多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制，各多肽的线性相关系数R≥0.998，由此计算出混合胶中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待检测阿胶样品中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3，然后，按下式计算出各样品中驴皮源成分的含量：阿胶中驴皮源成分的含量(％)＝(M1/1448.5–M2/770.8)×1772/M3×N2/N1。在本专利技术所述的真伪鉴定方法中，优选的，步骤1)所述的对照品溶液的制备包括以下步骤：1)基质溶液的制备：称取0.50g对照品检测基质于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀；2)对照品母液的制备：称取0.05g对照品检测基质于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，分别加入28.3mg的多肽I、15.1mg的多肽II和17.3mg的多肽III，用1％(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀；3)对照品溶液的制备：采用分步稀释的方法，以基质溶液为溶剂，将对照品母液稀释500～10000倍，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。在本专利技术所述的真伪鉴定方法中，优选的，步骤2)所述的待检测样品溶液的制备包括以下步骤：取0.5-5g待测复方阿胶制剂样品，重量记为N1，加入水至总体积为4-5ml，混合后，加入30％(w/w)的三氯乙酸溶液5ml，超声15min，4℃静置30min，离心后去除清液，沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重，重量记为N2；称取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)的NH4HCO3溶液(pH8.0)溶解后，用1％(w/w)的NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。在本专利技术所述的真伪鉴定方法中，优选的，步骤5)中液质联用仪检测的液相条件为：C18反相色谱柱，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0→40min，流动相A100％→50％，流动相B0％→50％，质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测。再进一步的，本专利技术还提出了所述的组合物或所述的试剂盒在检测阿胶及其复方制剂中的阿胶含量中的应用。直接对阿胶中驴皮源成分进行准确的含量检测，首先要找出能标志驴皮源成本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于阿胶及其复方制剂真伪鉴定的组合物，所述组合物由多肽I、多肽II、多肽III以及对照品检测基质组成，其特征在于：所述多肽I的氨基酸序列为Ala‑Gly‑Glu‑Thr‑Gly‑Ala‑Ser‑Gly‑Pro‑Hyp‑Gly‑Phe‑Ala‑Gly‑Glu‑Lys，多肽II的氨基酸序列为Gly‑Ala‑Ser‑Gly‑Pro‑Ala‑Gly‑Val‑Arg，多肽III的氨基酸序列为Gly‑Ser‑Glu‑Gly‑Pro‑Gln‑Gly‑Val‑Arg，对照品检测基质为鱼皮胶。

【技术特征摘要】
1.用于阿胶及其复方制剂真伪鉴定的组合物，所述组合物由多肽I、多肽II、多肽III以及对照品检测基质组成，其特征在于：所述多肽I的氨基酸序列为Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ala-Gly-Glu-Lys，多肽II的氨基酸序列为Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg，多肽III的氨基酸序列为Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg，对照品检测基质为鱼皮胶。2.含有权利要求1所述组合物的检测试剂盒。3.阿胶及其复方制剂真伪鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)对照品溶液的制备：称取对照品检测基质于量瓶中，加入NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，加入称量好的多肽I、多肽II和多肽III，完全溶解，摇匀，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；2)待检测样品溶液的制备：取待测样品，重量记为N1，加水溶解后，加入三氯乙酸溶液，超声，离心后去除上清液，沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重，重量记为N2；称取一定量沉淀干燥物于量瓶中，加入NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，续滤液中加入胰蛋白酶溶液，酶解；3)液质联用仪检测分别取对照品溶液、待检测样品溶液放入液质联用仪进行检测；选择m/z725.3→962.5、818.4，m/z386.4→499.3、643.3，m/z444.0→331.2、613.3作为检测离子对进行MRM扫描，其中选择m/z725.3→962.5、m/z386.4→499.3、m/z444.0→331.2分别作为多肽I、多肽II和多肽III的定量离子对进行定量检测；4)样品中驴皮源成分含量的计算以对照品溶液的各多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制，各多肽的线性相关系数R≥0.998，由此计算出混合胶中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待检测阿胶样品中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3，然后，按下式计算出各样品中驴皮源成分的含量：阿胶中驴皮源成分的含量(％)＝(M1/1448.5–M2/770.8)×1772...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦玉峰，郝向慧，郭尚伟，段小波，徐云鹏，王静，王玉娇，石永坚，周祥山，孙方玉，
申请(专利权)人：东阿阿胶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37