一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物、试剂盒及其检测方法，所述组合物由多肽以及对照品检测基质组成，所述多肽的氨基酸序列为Gln‑Gly‑Pro‑Ser‑Gly‑Thr‑Ser‑Gly‑Glu‑Arg，对照品检测基质为鱼骨胶。本发明专利技术的多肽为狗骨所特有，通过检测该多肽来判断是否含有狗源性成分，通过加入对照品检测基质来实现狗源性成分含量的精确检测。该方法具有含量检测准确、操作快捷的优点，在胶类中药及其复方制剂产品质量监控领域将具有广泛的应用前景。

Composition, reagent kit and detection method for detecting content of dog bone component in glue traditional Chinese medicine and its compound preparation

The invention discloses a method for detecting content of source components of dog bone glue in the compound preparation of traditional Chinese medicine and its composition, kit and detection method thereof, said composition comprising polypeptide and control test of matrix composition, amino acid sequence of the polypeptide is Gln Gly Pro Ser Gly Thr Ser Gly Glu Arg, control test for fish collagen matrix. The polypeptides of the present invention are unique to dog bones and determine whether a dog derived ingredient is detected by detecting the polypeptide and accurately detect the content of a dog's source component by adding a reference substance to detect a matrix. The method has the advantages of accurate content detection and quick operation, and has wide application prospect in the field of product quality monitoring of traditional Chinese medicine and its compound preparation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物、试剂盒及其检测方法。本专利技术属于医药检测

技术介绍
狗骨为为犬科动物狗的骨骼，具有健脾和络、活血生肌的功效，主治风湿痹痛、腰腿无力、四肢麻木、久痢、疮瘘。以狗骨为主药制成的制剂有狗骨胶、狗骨胶药酒、复方狗骨胶、壮骨伸筋胶囊、驳骨丸等。目前狗骨的鉴别主要为性状鉴别和显微鉴别，因专属性不强，常存在鉴别不准确等情况，对于用狗骨加工后的产品无法鉴别，更无法定量检测。因为缺乏专属性鉴别方法和定量方法，部分不法厂家进行造假或掺假，以降低成本获得非法利润。因此，目前迫切需要提出一种能够快速、准确检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的方法，进而实现对含狗骨源成分的产品的真伪鉴定。本专利技术从狗骨中主要成分出发，利用所含蛋白的氨基酸序列不同，找出狗骨特征性肽段，利用狗骨的特征肽段实现胶类中药及其复方制剂中狗骨源性成分含量的检测。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物。本专利技术的另一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的试剂盒。本专利技术的再一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物，所述组合物由多肽及对照品检测基质组成，所述多肽的氨基酸序列为Gln-Gly-Pro-Ser-Gly-Thr-Ser-Gly-Glu-Arg(SEQIDNO.1所示)，对照品检测基质为鱼骨胶。含有所述组合物的检测试剂盒也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术进一步提供了一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的方法，具体包括如下步骤：(1)对照品溶液的制备1)基质溶液的制备：将称量好的对照品检测基质置于量瓶中，加入NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，加NH4HCO3溶液稀释至刻度；2)对照品母液的制备：将称量好的对照品检测基质置于量瓶中，加入NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，将称量好的的多肽放入该量瓶中，用NH4HCO3溶液溶解并稀释至刻度；3)对照品溶液制备：以步骤1)制得的基质溶液为溶剂，将步骤2)制得的对照品母液稀释，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；(2)待检测样品溶液的制备将称量好的待测胶类中药置于量瓶中，加NH4HCO3溶液，超声使胶类中药完全溶解，加NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；(3)液质联用仪检测分别取步骤(1)制得的对照品溶液、步骤(2)制得的待检测样品溶液放入液质联用仪进行检测，选择m/z488.5→693.3、549.3作为检测离子对进行MRM扫描，其中选择m/z488.5→693.3作为多肽的定量离子对；(4)样品中狗骨源成分含量的计算以对照品溶液的多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制，线性相关系数R≥0.9992，由此计算出样品中多肽的含量，然后，按下式计算出各样品中狗骨源成分的含量：狗骨源成分的含量(％)＝(待测样品中多肽含量/待测样品的重量)÷(6.389×10-3)×100％。优选的，步骤(1)及步骤(2)所述的酶解温度为37℃。本专利技术的用于检测胶类中药及其复方制剂中的狗骨源成分含量的方法，其中，步骤(3)中液质联用仪检测的液相条件为：C18反相色谱柱，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：5→20min，流动相A95％→80％，流动相B5％→20％，质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测。优选的，所述的用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物，所述胶类中药为阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角胶、驴骨胶、牛骨胶、猪骨胶、羊骨胶或其他胶类中药。再进一步的，本专利技术还提出了所述的组合物或所述的试剂盒在检测胶类中药及其复方制剂中的狗骨源成分含量中的应用。直接对胶类中药中狗骨源成分进行准确的含量检测，首先要找出能标志狗骨源成分且在不同生产工艺的胶类中药中含量相对稳定的物质；其次胶类中药的成分非常复杂，检测时信号不稳定，因此该物质要满足在检测时具有较高的信号响应、较低的噪音及其他物质干扰，还应考虑检测信号的稳定性；第三需要设立合适的对照品等。对此，本专利技术通过选取狗骨源特征性多肽，从而实现对胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分的含量检测。实验证明，采用本专利技术的方法，能够准确地检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分的含量，且操作简单，在胶类中药产品质量监控领域将具有广泛的应用前景。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步的详细描述，其中：图1是对照品溶液MRM扫描模式下选择离子对m/z488.5→693.3监测的质谱图；图2是各种纯品胶类中药样品MRM扫描模式下选择离子对m/z488.5→693.3监测的质谱图。具体实施方式以下将参照附图，对本专利技术的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。实施例11、材料和试剂材料：各种胶类中药，包括狗骨胶、驴骨胶、牛骨胶、猪骨胶、羊骨胶、鱼骨胶(对照品检测基质)，分别用狗骨、驴骨、牛骨、猪骨、羊骨、鱼骨煎煮获得。多肽交由生物公司合成。试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯)。2、检测方法(1)对照品溶液的制备1)基质溶液的制备称取0.50g对照品检测基质于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH4HCO3溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀；2)对照品母液的制备将称量好的0.05g对照品检测基质置于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH4HCO3溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，称取38.1mg的多肽于该量瓶中，用1％(w/w)NH4HCO3溶液(pH8.0)溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；3)对照品溶液的制备采用分步稀释的方法，以步骤1)制得的基质溶液为溶剂，将步骤2)制得的对照品母液稀释1000倍，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h；(2)待测样品溶液的制备称取0.05g待测样品于25ml量瓶中，加入1％(w/w)NH4HCO3(pH8.0)溶液，超声使样品完全溶解，继续加1％(w/w)NH4HCO3(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h；(3)液质联用仪检测分别取步骤(1)制得的对照品溶液、步骤(2)制得的待检测样品溶液各5μl放入液质联用仪进行检测，液相条件：C18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：5→20min，流动相A95％→80％，流动相B5％→20％。质谱条件：电喷雾正离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物，所述组合物由多肽及对照品检测基质组成，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为Gln‑Gly‑Pro‑Ser‑Gly‑Thr‑Ser‑Gly‑Glu‑Arg，对照品检测基质为鱼骨胶。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物，所述组合物由多肽及对照品检测基质组成，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为Gln-Gly-Pro-Ser-Gly-Thr-Ser-Gly-Glu-Arg，对照品检测基质为鱼骨胶。2.一种含有权利要求1所述组合物的检测试剂盒。3.一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对照品溶液的制备1)基质溶液的制备：将称量好的对照品检测基质置于量瓶中，加入NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，加NH4HCO3溶液稀释至刻度；2)对照品母液的制备：将称量好的对照品检测基质置于量瓶中，加入NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，将称量好的的多肽放入该量瓶中，用NH4HCO3溶液溶解并稀释至刻度；3)对照品溶液制备：以步骤1)制得的基质溶液为溶剂，将步骤2)制得的对照品母液稀释，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；(2)待检测样品溶液的制备将称量好的待测胶类中药置于量瓶中，加NH4HCO3溶液，超声使胶类中药完全溶解，加NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；(3)液质联用仪检测分别取步骤(1)制得的对照品溶液、步骤(2)制得的待检测样品溶液放入液质联用仪进行检测，选择m/z4...

【专利技术属性】
技术研发人员：周祥山，郝向慧，郭尚伟，段小波，徐云鹏，王静，王玉娇，石永坚，庞慧慧，张大伟，
申请(专利权)人：东阿阿胶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37