抗人肿瘤坏死因子α的单克隆抗体的抗体可变区及其编码基因制造技术

特异性结合人肿瘤坏死因子－α的单克隆抗体的抗体可变区，含有具有特异性互补决定区的重链可变区和轻链可变区的至少之一。还提供了编码它的核酸分子、含有该核酸分子的重组载体和转化该重组载体的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及特异性结合人肿瘤坏死因子-α的单克隆抗体的抗体可变区、编码它的基因、含有该基因的重组载体和转化该重组载体的细胞。
技术介绍
人肿瘤坏死因子-α(下文称作“hTNFα”)是由三个17kDa蛋白质亚基组成的同源三聚体(Eck MJ et al.，JBC 2672119-2122，1992；Smith RA et al.，JBC 2626951-6954，1987)。hTNFα是由单核细胞和巨噬细胞分泌的炎性细胞因子，在多种细胞反应如坏死和凋亡中作为信号传递物起作用(Beyaert R et al.，FEBS Lett.3409-16，1994)。hTNFα产生导致组织破坏的促炎作用，所述组织破坏例如分解软骨和骨(Saklatvala，Nature 322547-549，1986)，以及增加中性粒细胞和淋巴细胞的粘附(Pober et al.，K.Immunol.1383319，1987)。此外，已知hTNFα在对抗感染性疾病和肿瘤的防御机制中起着重要作用(Fiers W，FEBSLett.285199-212，1991)。hTNFα参与炎性疾病、自身免疫病、细菌感染、癌症和退形性病变。在这些疾病中，hTNFα已经被当作特异性生理治疗类风湿性关节炎和节段性回肠炎(Crohn’sdisease)的有用靶蛋白。同时，还提示使用hTNFα抑制剂来治疗类风湿性关节炎。已经报道hTNFα在分离自早期类风湿性关节的滑膜细胞中过表达(Buchan G et al.，Clin.Exp.Immunol.73449-455，1988)，上述滑膜细胞用抗hTNFα单克隆抗体处理时，与类风湿性关节炎病变相关的细胞因子下降(Butler DM et al.，Eur Cytokine Netw.6225-230，1995)。另外，已经发现抗hTNFα抗体或重组可溶性hTNFα受体抑制胶原诱导的小鼠关节炎模型中关节的炎症和破坏(Wpiquet PF et al.，Immunology 77510-514，1992；Wooley PH et al.，J.Immunol.1516602-6607，1993；Williams RO et al.，Immnunology84433-439，1995)。此外，观察到过表达hTNFα的转基因小鼠中诱导了炎性关节炎(Keffer J et al.，EMBO J.104025-4031，1991)。这些结果表明hTNFα作为控制炎性细胞因子的直接或间接调节因子在类风湿性关节炎中起着重要作用。因此，需要开发对hTNFα具有高度选择性和反应性的单克隆抗体来治疗类风湿性关节炎。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是提供特异性结合hTNFα的单克隆抗体的抗体可变区。本专利技术的另一个目的是提供编码特异性结合hTNFα的单克隆抗体的抗体可变区的基因；包含该基因的重组载体；和转化该重组载体的细胞。根据本专利技术的一个方面，提供了特异性结合hTNFα的单克隆抗体的抗体可变区，其包含下列至少一种包含SEQ ID NO9、10和11的氨基酸序列的重链可变区；和包含SEQ ID NO12、13和14的氨基酸序列的轻链可变区。根据本专利技术的另一个方面，提供了编码特异性结合hTNFα的单克隆抗体的重链可变区的核酸分子，其中所述的重链可变区包含SEQ ID NO9、10和11的氨基酸序列。根据本专利技术的另一个方面，提供了编码特异性结合hTNFα的单克隆抗体的轻链可变区的核酸分子，其中所述的轻链可变区包含SEQ ID NO12、13和14的氨基酸序列。具体实施例方式本专利技术涉及特异性结合hTNFα的单克隆抗体的抗体可变区及其编码基因。为了制备特异性结合hTNFα的单克隆抗体，用重组hTNFα(Biosource PHC3011，Belgium)免疫小鼠。将从免疫小鼠获得的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0-Agl4，ATCCCRL1581)融合，以制备杂交瘤细胞库(pool)。将这种杂交瘤细胞进行后续的克隆和选择程序，以提供多种单克隆抗体。在这些单克隆抗体中，选择特异性结合hTNFα的某些单克隆抗体进行进一步分析。结果，获得了杂交瘤细胞系TSK11，其产生特异性结合hTNFα并对TNFα表现出高度结合亲和力的单克隆抗体。从杂交瘤细胞系TSK11提取总RNA，进行逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)，以合成单克隆抗体重链和轻链的cDNA分子。使用这种cDNA分子作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，从而获得编码重链可变区并包括SEQ ID NO5核苷酸序列的约470bp的cDNA分子；和编码轻链可变区并包括SEQ ID NO6核苷酸序列的约450bp的cDNA分子。分析这种重链和轻链可变区的互补决定区(CDR)，结果发现重链可变区具有三个CDR，位于SEQ ID NO7氨基酸序列中的31-35(SEQ ID NO9)、50-66(SEQID NO10)和99-106(SEQ ID NO11)氨基酸位置处。同样，观察到轻链可变区具有三个CDR，位于SEQ ID NO8氨基酸序列中的24-35(SEQ ID NO12)、51-57(SEQ ID NO13)和90-98(SEQ ID NO14)氨基酸位置处。因此，根据本专利技术一个实施方案的cDNA分子编码特异性结合hTNFα的单克隆抗体的重链可变区，其中所述的重链可变区包括SEQ ID NO9、10和11的氨基酸序列。优选的是，本专利技术提供了编码含SEQ ID NO7氨基酸序列的重链可变区的cDNA分子，更优选的是具有SEQ ID NO5核苷酸序列的cDNA分子。另外，根据本专利技术另一个实施方案的cDNA分子编码特异性结合hTNFα的单克隆抗体的轻链可变区，其中所述的轻链可变区包括SEQ ID NO12、13和14的氨基酸序列。优选的是，本专利技术提供了编码含SEQ ID NO8氨基酸序列的轻链可变区的cDNA分子，更优选的是具有SEQ ID NO6核苷酸序列的cDNA分子。编码重链可变区和轻链可变区的前述每一种cDNA分子可以插入到传统载体中以获得重组载体。在本专利技术的一个优选实施方案中，包括SEQ ID NO5或6核苷酸序列的cDNA分子可以插入到pCR2.1-TOPO(Invitrogen Co.U.S.A)中，以制备含有重链可变区的重组载体pTSK11-Hv，或含有轻链可变区的重组载体pTSK11-Lv。另外，可以将这种重组载体导入合适的宿主中，如诸如E.coli TOP10F的微生物。例如，用pTSK11-Hv或pTSK11-Lv转化E.coli TOP10F，以获得E.coli转化体，称作E.coli TOP 10F/pTSK11-Hv或E.coli TOP 10F/pTSK11-Lv，它们按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款，于2003年8月26日保藏在KoreanCollection for Type Cultures(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，Republic ofKorea)，保藏编号是KCTC 10514BP或KCTC 10515BP。上述重组载体可以根据常规方法从转化体中恢复(J.Sambro本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性结合人肿瘤坏死因子－α的单克隆抗体的抗体可变区，包含下列至少一种：包含ＳＥＱＩＤＮＯ：９、１０和１１的氨基酸序列的重链可变区；和包含ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、１３和１４的氨基酸序列的轻链可变区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜熙日，高仁泳，宋武泳，金昶硕，朴相久，李载善，柳泰亨，罗康仁，
申请(专利权)人：株柳韩洋行，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]