一组用于头颈鳞状细胞癌淋巴结转移速检的LAMP引物组CK19‑33制造技术

本发明专利技术筛选出用于快速检测HNSCC淋巴结转移的特异性标志物基因及其基因组合，即CK7、CK19、CK7+CK19；建立了HNSCC患者淋巴结快速检测技术体系，即应用RT‑LAMP法进行淋巴结状态检测；可将整个实验过程控制在四十分钟左右。本发明专利技术所述检测方法耗费时间短，实验温度低、结果准确性高且判读方式简便。以RT‑LAMP技术为基础建立的HNSCC淋巴结快速诊断体系，使此类患者术中快速判定其淋巴结转移状态成为可能。

For a group of lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the head and neck examination LAMP primer pairs CK19 33

The present invention screened for rapid detection of lymph node metastasis of HNSCC specific marker genes and gene combinations, namely CK7, CK19, CK7+CK19; HNSCC was established in patients with lymph node system rapid detection technology, the application of RT LAMP method lymph node status detection; the whole experiment process control in about forty minutes. The detection method of the invention has the advantages of short time consuming, low experimental temperature, high accurate result and simple interpretation mode. The RT LAMP technology for the rapid diagnosis system based on HNSCC lymph nodes, the lymph node metastasis may become rapid determination in these patients.

【技术实现步骤摘要】
一组用于头颈鳞状细胞癌淋巴结转移速检的LAMP引物组CK19-33
本专利技术属于生命科学与临床医学领域。更具体的，本专利技术涉及用于头颈鳞状细胞癌淋巴结转移速检的LAMP引物组，以及头颈鳞状细胞癌淋巴结转移的临床、尤其是术中快速检测方法。
技术介绍
头颈鳞状细胞癌(headandnecksquamouscellcarcinoma,HNSCC)在全球癌症发病率中排第六位，全世界每年有近65万新增病例，近年来恶性肿瘤诊治手段日新月异，然而HNSCC的5年生存率并没有明显提高。HNSCC治疗方案的选择及预后判断主要取决于TNM分期以及组织学分级，其中颈淋巴结转移情况对预后的影响较大。临床上约47％的HNSCC患者就诊时已经伴有颈淋巴结转移。因此颈淋巴结转移的准确检测对于HNSCC选择合理的治疗方案以及个体预后至关重要。目前国内外颈淋巴结的转移状态主要依赖于局部触诊、影像学检查、病理检查等临床诊断手段。尽管随着超声、CT、MRI、PET、超声引导细针穿刺细胞学检查、术中冰冻切片病理检查等诊断技术的不断发展，颈淋巴结转移在术前术中诊断方面已有了一定进步，但迄今为止尚没有一种方法的诊断正确率能够完全满足临床需要，对于直径小于2mm的微转移灶更是无法准确检测。由于术前术中诊断手段较为局限，目前有10％～20％术前临床诊断为颈淋巴结转移阳性(clinicalN+,cN+)的患者，术后病理检查未发现淋巴结转移，而同时约有25％术前临床诊断为颈淋巴结转移阴性(clinicalN0,cN0)的患者术后病理却为淋巴结转移阳性。对于这1/4的cN0患者如果进行随访观察，患者将面临治疗不充分而带来的巨大风险；而对于另3/4的cN0患者和前述部分cN+患者，额外的治疗则完全没有必要，过度治疗带给患者的只有治疗风险和生活质量下降。现已有研究开始探索分子生物学检测技术，即通过逆转录-多聚酶链反应(qRT-PCR)检测上皮来源特异mRNA的表达来判断淋巴结的转移状态。但常规的qRT-PCR分析一般需要3-4个小时的时间，不利于术中进行，因此临床特别需要一种能够准确、快速检测颈淋巴结状态的分子生物学方法。
技术实现思路
为解决上述技术问题，填补现有技术空白，本专利技术在初步筛选出与HNSCC颈淋巴结转移相关的特异性分子标志物的基础上，建立了头颈部鳞状细胞癌颈淋巴结转移术中快速检测方法，即应用RT-LAMP检测方法进行检测，在手术过程之中即可判断淋巴结的转移状态，指导术中治疗，确立有效、快速、低廉的检测方法；不仅为肿瘤诊断的研究提供新的依据，而且能够有效减少患者的痛苦，提高患者的预后，也可以大幅节省患者和医院的开支，具有非常重要的临床和社会意义。本专利技术具体技术方案如下：1、收集手术切除的新鲜标本：组织标本切取后，向临床医师确定肿瘤部位、范围及肉眼可以判别的浸润情况，并进行描述和详细的临床记录。2、筛选HNSCC淋巴结转移特异性标志物基因：通过文献报道和检索数据库确定检测HNSCC淋巴结转移的可能mRNA标志物。检索来源包括：PubMed、OMIM、UniGene、GeneCards、CGAP。共预选出39个候选基因。使用qRT-PCR实验对上述候选基因进行2轮筛选：1)第一次基因筛选：选择原发HNSCC患者19例肿瘤组织和非癌患者的15例良性淋巴结组织，非癌患者的诊断分别为：11例诊断结节性甲状腺肿、2例诊断颈动脉体瘤、1例诊断先天性甲状舌管囊肿、1例诊断头颈部皮下囊肿。应用qRT-PCR法分析上述39个候选基因，选取明确差异表达的4个基因(CK7、CK19、EGFR、TACSTD1)用于后续研究；2)第二次基因筛选：分别选择原发HNSCC患者的36例肿瘤组织、19例病理诊断为阳性的淋巴结和19例病理诊断为阴性的淋巴结，提取初步筛选出的4个基因的mRNA，进行qRT-PCR分析，确认能够区分HNSCC肿瘤组织、阳性淋巴结和阴性淋巴结的基因CK7、CK19并进行分析，并进一步得到最佳基因组合CK7+CK19。3、LAMP检测流程的建立在确定了CK7、CK19以及CK7+CK19基因组合的基础上，开始着手建立LAMP实验流程。整个流程建立包括实验试剂盒缓冲底液的制备、CK19及CK7引物设计及最佳反应温度测定三个方面。而其中的核心即引物设计，在对最佳引物的筛选实验中，同时得到了适当的缓冲底液及最佳反应温度。本专利技术提供了一种CK7/CK19基因或蛋白在头颈鳞状细胞癌(HNSCC)淋巴结转移快速检测或诊断中的应用。本专利技术提供了一组用于CK7基因RT-LAMP检测的引物组，其核苷酸序列如SEQIDNO.8-12所示；本专利技术提供了三组用于CK19基因RT-LAMP检测的引物组，其核苷酸序列如SEQIDNO.25-29、35-40、41-46所示；以及所述引物组在HNSCC淋巴结转移快速检测或诊断中的应用。本专利技术提供了一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含扩增CK7和/或CK19基因的特异性引物，优选的，所述特异性引物为SEQIDNO.8-12、25-29、35-40、41-46所示引物组；以及所述试剂盒在HNSCC淋巴结转移快速检测或诊断中的应用。本专利技术提供了一种快速检测头颈鳞状细胞癌(HNSCC)淋巴结转移的方法，其特征在于，使用RT-LAMP方法检测淋巴结中CK7基因的表达水平。具体步骤如下：1)分离淋巴结组织，并提取总RNA；2)进行RT-LAMP扩增。所述LAMP扩增优选使用SEQIDNO.8-12所示引物组；扩增温度为65℃，恒温反应时间为60min。本专利技术提供了一种CK7基因/蛋白与CK19基因/蛋白在头颈鳞状细胞癌(HNSCC)淋巴结转移快速检测或诊断中的联合应用，即使用RT-LAMP方法检测淋巴结中CK7基因和CK19基因的表达水平。所述RT-LAMP检测优选使用下述引物组：1)SEQIDNO.8-12所示引物；2)SEQIDNO.25-29所示引物；3)SEQIDNO.35-40所示引物；或/和4)SEQIDNO.41-46所示引物。本专利技术筛选出用于快速检测HNSCC淋巴结转移的特异性标志物基因及其基因组合，即CK7、CK19、CK7+CK19；建立了HNSCC患者淋巴结快速检测技术体系，即应用RT-LAMP法进行淋巴结状态检测，并将整个实验过程控制在四十分钟左右，适应于术中快速检测需求。通过对HNSCC患者淋巴结RT-LAMP检测数据和石蜡病理结果的对比，充分验证该检测方法的准确性。最终证明了RT-LAMP技术的优越性，即：耗费时间短，实验温度低、结果准确性高且判读方式简便。以RT-LAMP技术为基础建立的HNSCC淋巴结快速诊断体系，使此类患者术中快速判定其淋巴结转移状态成为可能。附图说明图1：淋巴结取材示意图。图2：a.肿瘤瘤体石蜡病理切片-箭头所示为喉癌瘤体细胞；b.肿瘤瘤体石蜡病理切片-高倍镜下可见明显癌栓。图3：第一次筛选标本mRNA电泳图，M：DNAMarker：DM2000，从下往上依次为100,250,500,750,1000和2000bp，其中750bp为亮带，此处展示的标本为HNSCC1-15，LN1-9。图4：TACSTD1扩增曲线及溶解曲线。图5：CK19扩增曲线及溶解曲线。图6：CK7扩增曲线及溶解曲线。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
CK19基因或蛋白作为检测靶点在制备头颈鳞状细胞癌(HNSCC)淋巴结转移快速检测或诊断制剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.CK19基因或蛋白作为检测靶点在制备头颈鳞状细胞癌(HNSCC)淋巴结转移快速检测或诊断制剂中的应用。2.一组用于CK19基因RT-LAMP检测的引物，其特征在于，所述引物包含SEQIDNO.25-29所示引物。3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含扩增CK19基因的特异性引物，优选的，所述特异性引物为权利要求2所述引物。4.权利要求2所述引物在制备头颈鳞状细胞癌(HNSCC)淋巴结转移快速检测或诊断制剂中的应用。5.一种快速检测CK19基因表达水平的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)分离待测组织，并提取总RNA；2)进行RT-LAMP扩增。6.权利要求5所述方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪鑫，邰隽，韩阳，葛文彤，张杰，张亚梅，王生才，房居高，陈晓红，钟琦，李平栋，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京儿童医院，
类型：发明
国别省市：北京,11