一种壳寡糖络合物及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种壳寡糖络合物，其为分子量为1000～3000Da的壳寡糖与Mn+4配位形成的壳寡糖螯合锰。本发明专利技术将Mn

Chitosan oligosaccharide complex and preparation method thereof

The present invention provides a chitosan oligosaccharide complex, which is a chitosan oligosaccharide whose molecular weight is between 1000 and 3000Da, and chitosan chelated with Mn+4 is chelated with manganese. The invention relates to Mn

【技术实现步骤摘要】
一种壳寡糖络合物及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种壳寡糖络合物及其制备方法。
技术介绍
糖尿病(diabetesmellitus,DM)是一种常见的内分泌代谢病,具有遗传倾向,是由于胰岛素绝对或相对不足所致的血糖及尿糖增高为主要特征的并导致糖、蛋白和脂肪代谢障碍的全身慢性代谢疾病,常伴发心脑血管、肾、眼及神经等多种并发症,危害性大。据WHO报告,糖尿病已成为世界上继恶性肿瘤、心脑血管病后第3位严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。锰的化合价有+2、+3、+4、+6和+7。其中以+2（Mn2+的化合物）、+4（二氧化锰）、+6（锰酸盐，如K2MnO4）和+7（高锰酸盐，如KMnO4）为稳定的氧化态。锰可以通过影响胰岛素的代谢而影响糖代谢，直接影响葡萄糖的生成。锰对胰岛素合成量的影响是通过胰岛素β细胞进行的。早在100多年前就有利用锰化合物进行糖尿病治疗的报道。开发应用壳寡糖(chitosanoligosaccharideCOS)是甲壳素和壳聚糖天然资源开发应用的核心问题,也是当今生物制药领域的热点之一。壳寡糖不但水溶性好,本身还具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抗炎、调节血脂和血糖、增强免疫、活化肠道菌群等多种生理作用,具有比壳聚糖更优越的生理及生化活性。单纯应用壳寡糖降血糖在国内外已经有部分研究，但是特定分子量壳寡糖螯合锰的制备方法与在降低血糖上的应用尚未见报道。专利技术人在实验中发现，通过将锰螯合到特定分子量壳寡糖上之后，该络合物对降低血糖有良好的效果。本专利技术有望对糖尿病的治疗提供一个新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种壳寡糖络合物及其制备方法及其制备方法。其具体的技术方案如下：一种壳寡糖络合物，其为分子量为1000～3000Da的壳寡糖与Mn+4配位形成的壳寡糖螯合锰。进一步，所述络合物中锰的含量为5%-8%。进一步，所述壳寡糖络合物是一种棕红色粉末，按作用浓度65-80mg/L配制溶液。一种壳寡糖络合物的制备方法，其包括以下的步骤：步骤一：制备特定分子量的壳寡糖：A.将壳聚糖样品,溶解于冰乙酸溶液中；B.加入壳聚糖酶，搅拌；C.加入氢氧化钠，室温下静置、离心、沉淀；D.将沉淀后的上清液用截留分子量1000～3000Da的中空纤维素膜超滤，随后将滤过液装入截留分子量1000Da的透析袋中透析；E.将透析液冷冻干燥，得到分子量范围1000-3000Da的壳寡糖；步骤二：制备壳寡糖螯合锰：F.将步骤一中得到的分子量范围1000-3000Da的壳寡糖和二氧化锰（MnO2）共同溶解于三蒸水中；G.加入2～3倍量无水乙醇，进行螯合；H.将螯合液置于孔径0.22μm滤膜上抽滤，再用三蒸水洗涤沉淀物；I.将洗涤后的沉淀物进行冷冻干燥，得到壳寡糖螯合锰。进一步，步骤A中，所述壳聚糖与冰乙酸溶液的质量比为1：10；所述冰乙酸溶液的质量百分比为2%。进一步，步骤B中，按壳聚糖与壳聚糖酶1：0.02比例，加入活力单位为180U/g的壳聚糖酶，在45℃温度下，搅拌3小时。进一步，步骤C中，按壳聚糖与氢氧化钠1：0.42比例，加入氢氧化钠，室温下静置30min，以8000rpm/min转速离心10min后沉淀。进一步，步骤D中，透析用磷酸盐缓冲液，缓冲液的摩尔浓度为0.15mol/L，pH值5.8。进一步，步骤F中，壳寡糖、二氧化锰、三蒸水的用量比为1：0.2：10，将壳寡糖和二氧化锰溶于三蒸水后，先调pH至7.0，37℃搅拌1小时；后将pH调至8.0，搅拌1小时。进一步，步骤G中，加入无水乙醇后，在42℃下螯合30分钟。本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：本专利技术将Mn+4螯合到1000-3000Da壳寡糖上，经实验验证，壳寡糖螯合锰显著促进胰岛β细胞的生长,可以缩短潜伏期及对数生长期的时间，可以显著促进胰岛细胞的生长，该络合物对降低血糖有良好的效果。附图说明图1不同浓度壳寡糖螯合锰对胰岛β细胞增殖的影响；图2不同浓度壳寡糖螯合锰对胰岛细胞的促胰岛素分泌作用。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的一种壳寡糖络合物及其制备方法作进一步详细的说明。实施例1：本实施例中的，一种壳寡糖络合物，其中壳寡糖脱乙酰度≧95%，分子量范围1000-3000Da，锰的含量5%-8%。壳寡糖与Mn+4配位形成壳寡糖螯合锰。优选的制备工艺如下：1.特定分子量壳寡糖的制备：①称取100克壳聚糖（脱乙酰度≧95%）样品,溶解于1L质量百分比为2%的冰乙酸溶液中。②加入2克壳聚糖酶（酶活力单位180U/g）,45℃搅拌3小时。③加入氢氧化钠42克，室温下静置30min，8000rpm/min离心10min后弃沉淀。④离心后上清液用截留分子量3000Da的中空纤维素膜超滤，随后将滤过液装入截留分子量1000Da的透析袋中4℃透析12小时。透析用缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液的摩尔浓度为0.15M，pH值5.8。⑤将透析液冷冻干燥24小时，即得到分子量范围1000-3000Da的特定分子量壳寡糖。2.壳寡糖螯合锰的制备①称取10克特定分子量壳寡糖，2克二氧化锰（MnO2），共同溶解于100ml三蒸水中，调pH至7.0，37℃搅拌1小时；将pH调至8.0，搅拌1小时。②加入200ml无水乙醇，42℃螯合30分钟。③将螯合液置于孔径0.22μm滤膜上抽滤，再用三蒸水洗涤沉淀物3次。④将洗涤后的沉淀物进行冷冻干燥，即得到壳寡糖螯合锰。实施例2：壳寡糖螯合锰对胰岛β细胞株NIT-1的作用实验：胰岛β细胞株NIT-1用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养,在培养瓶中长满至单层后,用2.5g/L胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液,以5.0×107/L的浓度接种于96孔板上,实验组中加入不同浓度的壳寡糖螯合锰,在50mL/LCO2,37℃,饱和湿度的恒温培养箱中培养,加入不含样品的培养液作为对照组,分别在加样后24、48、72、120、144和168h取出,MTT法于酶标仪上492nm测吸光度值(A值)。图1显示了不同浓度壳寡糖螯合锰对胰岛β细胞增殖的影响；从图1可以看出不同浓度壳寡糖螯合锰均可以显著促进胰岛β细胞的生长,缩短潜伏期及对数生长期的时间,对照组要延迟48h才能长满孔。75mg/ml的壳寡糖螯合锰在一代生长期内可以显著促进胰岛细胞的生长,72h细胞密度达到最大,活力高于其他组。培养6d后进行胰岛素刺激释放试验,吸出培养基,将培养细胞用Hank's液洗净,先后置于含5.6mmol/L,16.7mmol/L葡萄糖的培养液中,37℃各孵育2h,取培养液的上清液测定胰岛素释放量。图2显示了不同浓度壳寡糖螯合锰对胰岛细胞的促胰岛素分泌作用。图2中可以看出，6d以后实验组与对照组相比较,胰岛素释放量逐渐增高。在第10天时,实验组与对照组差异最为明显。75mg/ml的壳寡糖螯合锰对促胰岛素分泌作用最为显著。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种壳寡糖络合物，其特征在于：其为分子量为1000～3000Da的壳寡糖与Mn

【技术特征摘要】
1.一种壳寡糖络合物，其特征在于：其为分子量为1000～3000Da的壳寡糖与Mn+4配位形成的壳寡糖螯合锰。2.根据权利要求1所述的一种壳寡糖络合物，其特征在于：所述络合物中锰的含量为5%-8%。3.根据权利要求1所述的一种壳寡糖络合物，其特征在于：所述壳寡糖络合物是一种棕红色粉末，按作用浓度65-80mg/L配制溶液。4.一种壳寡糖络合物的制备方法，其特征在于：其包括以下的步骤：步骤一：制备特定分子量的壳寡糖：A：将壳聚糖样品,溶解于冰乙酸溶液中；B：加入壳聚糖酶，搅拌；C：加入氢氧化钠，室温下静置、离心、沉淀；D：将沉淀后的上清液用截留分子量1000～3000Da的中空纤维素膜超滤，随后将滤过液装入截留分子量1000Da的透析袋中透析；E：将透析液冷冻干燥，得到分子量范围1000-3000Da的壳寡糖；步骤二：制备壳寡糖螯合锰：F：将步骤一中得到的分子量范围1000-3000Da的壳寡糖和二氧化锰（MnO2）共同溶解于三蒸水中；G：加入2～3倍量无水乙醇，进行螯合；H：将螯合液置于孔径0.22μm滤膜上抽滤，再用三蒸水洗涤沉淀物；I：将洗涤后的沉淀物进行冷冻干燥，得到壳寡糖螯合锰。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓艳，公衍军，
申请(专利权)人：青岛麦迪尔生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37