植物甾体配糖体的制备方法技术

植物甾体配糖体的制备方法，植物原料经干燥粉碎后，用醇提取，提取液过滤、浓缩、回收溶剂，得醇提取物，醇提取物用水饱和的正丁醇萃取，正丁醇萃取液减压浓缩，回收溶剂，得正丁醇提取物，经硅胶柱层析分离纯化，进一步干燥或结晶，得到替告皂甙元配糖体的富集部位或单体化合物即植物甾体配糖体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学领域化合物的分离提取方法，具体地，涉及具有抗致病性真菌活性的。
技术介绍
甾体配糖体为植物的一类次生代谢产物，广泛存在于植物界。甾体配糖体是甾体药物的重要天然原料。近年，甾体配糖体的抗肿瘤活性、心血管活性、镇痛抗炎活性等已引起广泛的重视。甾体配糖体对致病性真菌的抗菌活性至今未有系统的报道。替告皂甙元的配糖体存在于龙舌兰科、百合科、茄科、玄参科、菝葜科、以及蒺藜科等多种植物中，对cAMP磷酸二酯酶，以及人宫颈癌Hela和JTC-26细胞系具有抑制作用，尚未见有关抗菌作用的报道。这类植物甾体配糖体提取分离纯化的难度较大，也未有批量生产制备的报道。
技术实现思路
本专利技术在大量筛选的基础上，发现以替告皂甙元为母核的C-27甾体配糖体对致病性真菌具有显著的抗菌作用。所涉及的化合物是植物中天然存在的，具有抗致病性真菌活性的甾体配糖体，其结构通式如I所示。其中，甾体母核为(25R)-3β-羟基-5α-螺甾烷，又称替告皂甙元(tigogenin)。取代基R为由3个或3个以上的单糖基组成的糖链。单糖基可以是半乳糖基、葡萄糖基、鼠李糖基或木糖基等。其糖链的内侧糖基为半乳糖基，并有一个葡萄糖基连接在内侧半乳糖基的C-4位上。通过构效关系的研究分析，进一步发现替告皂甙元配糖体抗菌作用的强度与糖链上单糖基的种类、数量、以及连接方式均有一定的关系。 结构通式I 本专利技术的目的在于提供一种具有抗致病性真菌活性的。该方法简单易行，适于批量制备和工业化生产，所得到的植物配糖体具有显著的抗真菌活性，可作为新药开发的原料，也可作为食品保鲜剂和功能化妆品的原料，可广泛用于制药、食品和化妆品等行业。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案植物原料经干燥粉碎后，用醇提取。提取液过滤、浓缩、回收溶剂，用水饱和的正丁醇萃取。正丁醇萃取液减压浓缩，回收溶剂，得到正丁醇提取物。经硅胶柱层析分离纯化，进一步干燥或结晶，即得到替告皂甙元配糖体的富集部位或单体化合物。经过活性测定，评价其抗真菌的作用。上述技术方案中用于提取替告皂甙元配糖体的植物原料为龙舌兰科龙舌兰属(Agave)植物，如番麻(Agave sisalana Perr)、剑麻(A.amaniensis)、金边龙舌兰(A.americana var.marginata)、短叶龙舌兰(A.angustifolia Haw.)、银边短叶龙舌兰(A.angustifolia var.marginata)，狭叶龙舌兰(A.cantala Roxb)，灰叶剑麻(A.fourcroydes)等；晚香玉属(Polianthes)晚香玉(Polianthes tuberosa)；丝兰属(Yucca)植物，如凤尾兰(Yucca gloriosa)、丝兰(Y.filamentosa)、王兰(Y.aloifolia)等。葱科葱属(Allium)植物，如薤白(Allium macrostemon)、大蒜(A.sativum)等；Triteleia属Triteleia lacteal。玉簪科玉簪属(Hosta)紫玉簪(Hosta longipes)等。知母科知母属(Anemarrhenae)知母(Anemarrhenaeasphodeloides Burge.)。茄科茄属(Solanum)植物，如茄(Solanum melongena)，龙葵(S.nigrum)等；辣椒属(Capsicum)植物辣椒(Capsicum annuum)等；夜香树属(Cestrum)植物夜香树(Cestrum diurnum)。玄参科毛地黄属(Digitalis)植物，如毛地黄(Digitalis purpurea)，黄花毛地黄(D.lanata)等。菝葜科菝葜属(Smilax)植物华东菝葜(Smilax sieboldii)等。蒺藜科蒺藜属(Tribulus)蒺藜(Tribulus terrestris)等。上述技术方案中用于提取的醇类溶剂，包括但不限于乙醇、甲醇等低级醇，以及低级醇与水的混和溶剂。提取的过程包括但不限于加热回流提取、超声波提取、微波提取、室温或低温提取、渗滤等多种技术和方法。醇提取液经减压回收溶剂后，即得到醇提取物。上述技术方案中用于柱层析分离的填充剂为硅胶、键合硅胶等。柱层析分离纯化用的硅胶填充剂包括但不限于八烷基键合硅胶(Rp-8)和十八烷基键合硅胶(Rp-18)等。提取物与上述分离材料的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶10-15。上述技术方案中抗真菌活性的评价方法如下抗真菌活性测定参照修订后的NCCLS(National Committee of the Clinical Laboratory Standards)方法进行。以两性霉素B(Amphotericin B)作为阳性对照药品。致病性真菌菌株包括白色念珠菌(Candida albicans)，光滑念珠菌(Candida，abrata)，克柔念珠菌(Candida krusei)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和烟曲菌(Aspergillus fumigatus)等。待测样品溶于二甲基亚砜(DMSO)，用0.9％盐水和20％DMSO逐步稀释成不同浓度，移至96微孔板中。将预先准备好的真菌菌丝体加入到样品中，使体积达到200μl。加好菌种后的样品在培养前和培养后分别在630nm或544ex/590em(Alamer Blue)波长范围内进行光密度检测。计算50％抑制浓度(IC50)，最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)。与阳性对照进行比较，评价样品的抗真菌活性。若IC50，MIC和MIC值小于20μg/ml，即可认为有抗菌活性。本专利技术制备抗真菌活性的甾体配糖体的具体步骤如下1.植物原料去杂、洗净、烘干、粉碎成粗粉(过20-40目筛)。2.将该植物粗粉用低级醇(可以是甲醇或乙醇)加热回流提取2-3次，每次提取时间为2-3小时，过滤、合并滤液，浓缩、回收溶剂，干燥，得醇提取物。3.用少量水将醇提取物溶解，过滤，以水饱和的正丁醇进行萃取。萃取3次后，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，回收正丁醇。将残留的浓缩液缓缓倾入大孔吸附树脂(如DiaionHP20SS，D-101，KB-8等)层析柱的上端。层析柱的柱径高比为1∶10-15，正丁醇提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15。以不同浓度的低级醇(可以是甲醇或乙醇)梯度洗脱，同时用薄层层析法检测指导洗脱。薄层层析的条件为氯仿-甲醇-水(70∶30∶5)为展开剂，10％的硫酸-乙醇液为显色剂。收集含有甾体配糖体的洗脱液，合并，浓缩，回收溶剂，得醇洗脱物。4.将醇洗脱物用少量甲醇溶解，倾入硅胶层析柱的上端。柱径高比为1∶10-15，醇洗脱物与硅胶的重量比为1∶30-50。以不同浓度的氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析法检测指导洗脱。薄层层析的条件为氯仿-甲醇-水(70∶30∶5)为展开剂，10％的硫酸-乙醇液为显色剂。收集含有甾体配糖体的洗脱液，合并，浓缩，回收溶剂，得到淡黄色粉术状的甾体配糖体富集部位。5.将淡黄色粉末状的甾体配糖体富集部位用少量甲醇溶解，缓缓倾入键合硅胶(如Rp-8，Rp-18等)层析柱上端。层析柱的柱径高比为1∶10-15，提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
植物甾体配糖体的制备方法，其特征是植物原料经干燥粉碎后，用醇提取，提取液过滤、浓缩、回收溶剂，得醇提取物，醇提取物用水饱和的正丁醇萃取，正丁醇萃取液减压浓缩，回收溶剂，得到正丁醇提取物，经硅胶柱层析分离纯化，进一步干燥或结晶，得到替告皂甙元配糖体的富集部位或单体化合物即植物甾体配糖体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨崇仁，张颖君，李兴从，张影，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]