一种缢蛏抗氧化肽的制备方法技术

本发明专利技术提供一种缢蛏抗氧化肽的制备方法，操作步骤为：1）酶解；2）超滤；3）制备缢蛏抗氧化肽。有益效果为：采用复合酶制剂酶解缢蛏，不仅能得到抗氧化肽，不会破坏抗氧化肽的活性，而且酶解速度快，缩短反应时间；加入助溶剂能抗氧化肽在Tris—HCl缓冲液中溶解度增加，提高抗氧化肽的提取率；析出剂能使抗氧化肽分子周围的水化膜减弱或消失，析出率高，而且杂质蛋白质和多肽的析出少；制备的缢蛏抗氧化肽纯度高，活性强，抗氧化作用很好；使用酶解技术制备缢蛏抗氧化肽绿色安全，可放心用于抗氧化保健品或药物的生产。

A preparation method of sinonovaculaconstricta antioxidant peptide

The invention provides a preparation method of sinonovaculaconstricta antioxidant peptide, the operation steps are as follows: 1) 2) enzymatic hydrolysis; ultrafiltration; 3) preparation of sinonovaculaconstricta antioxidant peptide. The beneficial effect of using compound enzyme enzymolysis razor clam, can not only obtain antioxidant peptides, not destroy activity of antioxidant peptides, and enzymolysis speed, shorten the reaction time; the addition of cosolvent can increase the solubility of antioxidant peptides in Tris HCl buffer, increase the extraction rate of antioxidant peptide; antioxidant agent can make precipitation peptide molecular hydration around the film weakened or disappeared, precipitation rate is high, and the precipitation of impurities of protein and polypeptide; sinonovaculaconstricta antioxidant peptide preparation of high purity, high activity, good anti-oxidation effect; the solution preparation technology of anti oxidative peptide sinonovaculaconstricta green safety can be assured for the use of enzymes, antioxidant supplements or drugs the production.

【技术实现步骤摘要】
一种缢蛏抗氧化肽的制备方法
本专利技术涉及多肽的制备
，具体是一种缢蛏抗氧化肽的制备方法。
技术介绍
海洋贝类资源丰富且富含许多生理活性物质，因而逐渐被广泛研究和应用。缢蛏（Sinonovaculaconstricta）俗名蛏子，属瓣鳃纲、异齿亚纲、帘蛤目、灯塔蛤科、缢蛏属，在我国沿海均有分布，产量较大，为我国四大养殖贝类之一，缢蛏肉味鲜美，营养丰富，富含人体生命活动所需的各种必需氨基酸、不饱和脂肪酸等营养物质。缢蛏性寒、可补阴去邪热，治烦闷、冷痢、热痢、妇人产后虚损、虚热等症，具有较高的药用食用价值，对缢蛏肉的酶解条件进行研究，发现提取得到的糖胺聚糖对体外培养的HL-60细胞均有一定抑制作用，且随着用量增加抑制作用增强。张永娟等，提取缢蛏多肽能促进小鼠胸腺和脾脏发育及迟发型变态反应的发生，提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平；PSD还能提高血清SOD、GSH-Px水平，降低血清MDA含量。活性多肽由于具有敏感性高、稳定性好及副作用少等优点，已被用作抗肿瘤药物开发的一个重要来源。研究已经证实，食物蛋白通过蛋白酶酶解方式，可以得到功能多样的活性多肽。对于缢蛏，在抗高血压方面的研究还很少，特别是利用酶解技术提取多肽在抗肿瘤方面的研究并未见报道。现在已有很多研究采用酶解技术成功提取了动物多肽，说明从缢蛏中提取抗氧化肽可行性很高。现有技术如授权公告号为CN104004808B的中国专利，公开了一种具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽及其酶解制备方法与应用，制备方法包括：全蝎干体清洗干燥，粉粹成粉末；加入水均匀搅拌，pH调至7~10，以100~300r/min的速度匀速搅拌1h~3h，离心，上清液pH调至3~7，得蛋白沉淀；将蛋白加水溶解，比例为5~20g：100mL，pH调至7.5~10，再加入碱性蛋白酶，该酶体积与蛋白重量之比0.1~5mL：100g，温度40~80℃，搅拌速度100~300r/min，时间1~5h；将酶解液通过阴离子交换柱分离纯化，收集干燥，得抗凝血肽粉。该方法为抗凝血类活性物质增加了新来源，实现原料的充分利用，具有产品活性高、制备过程方便可行、环保等优点，所制得的抗凝血肽粉可作为预防血栓、溶血栓、降血稠类食品的原料。该方法制备的抗凝血肽粉中有一部分多肽在制备过程中失去了活性，且多肽提取率和纯度都有待提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简单，提取率高，提取的抗氧化肽纯度高，活性强的缢蛏抗氧化肽的制备方法。本专利技术针对
技术介绍
提到的问题，采取的技术方案为：1）酶解：将缢蛏用冰水冲洗2~4次，将泥沙和附着缢蛏表面的污渍和微生物清洗干净，沥干。在鼓风机中干燥，温度为50~70℃，干燥时间1~2h，用粉碎机粉碎，过100~400目筛，按料液体积比为1:20~1:30加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.2~1.8mol/L，水浴加热搅拌，用盐酸调节pH。加入复合酶制剂木瓜蛋白酶6~12份，中性蛋白酶5~10份，半胱氨酸0.5~1.2份，亚硫酸钠0.05~0.08份，氯化钙0.2~0.5份，聚谷氨酸0.01~0.02份和甲钴胺0.002~0.005份和助溶剂水杨酸钠4~12份，瓜氨酸0.05~0.08份和氨甲酰磷酸0.008~0.012份。使用上述复合酶制剂酶解缢蛏不仅能得到抗氧化肽，不会破坏抗氧化肽的活性，而且酶解速度快，缩短反应时间。加入助溶剂能抗氧化肽在Tris—HCl缓冲液中溶解度增加，提高抗氧化肽的提取率。酶解温度为50~60℃，pH为6.5~7.2，酶解时间为3~5h，离心取上清液，加入析出剂硫酸铵2~5份，氯化钠1~4份，静置过滤得粗抗氧化肽。上述析出剂能使抗氧化肽分子周围的水化膜减弱或消失，析出率高，而且杂质蛋白质和多肽的析出少；2）超滤：在步骤1得到的抗氧化肽中按体积比1:10~1:15加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.2~1.8mol/L，选用3000~4500Da的超滤膜进行超滤，压力为1000~2000Pa；3）制备缢蛏抗氧化肽：将步骤2得到的超滤液过HPLC柱，固定相为ZrO2/SiO2，流动相为1.2~1.8mol/L的Tris—HCl缓冲液，收集含抗氧化肽的洗脱液，旋转蒸发掉流动相留下缢蛏抗氧化肽固体，冷冻干燥，研磨，得到缢蛏抗氧化肽粉末。上述方法制备的缢蛏抗氧化肽纯度高，活性强，抗高血压作用很好；使用酶解技术制备缢蛏抗氧化肽绿色安全，可放心用于抗氧化保健品或药物的生产。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：采用复合酶制剂木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，半胱氨酸，亚硫酸钠，氯化钙，聚谷氨酸和甲钴胺酶解缢蛏，不仅能得到抗氧化肽，不会破坏抗氧化肽的活性，而且酶解速度快，缩短反应时间；加入助溶剂水杨酸钠，瓜氨酸和氨甲酰磷酸能抗氧化肽在Tris—HCl缓冲液中溶解度增加，提高抗氧化肽的提取率；析出剂硫酸铵，氯化钠能使抗氧化肽分子周围的水化膜减弱或消失，析出率高，而且杂质蛋白质和多肽的析出少；制备的缢蛏抗氧化肽纯度高，活性强，抗氧化作用很好；使用酶解技术制备缢蛏抗氧化肽绿色安全，可放心用于抗氧化保健品或药物的生产；操作步骤简单，成本低廉，适合大规模生产。具体实施例下面通过实施例对本专利技术作进一步说明：实施例1：一种缢蛏抗氧化肽的制备方法，具体操作步骤为：1）酶解：将缢蛏用冰水冲洗2~4次，将泥沙和附着缢蛏表面的污渍和微生物清洗干净，沥干。在鼓风机中干燥，温度为50~70℃，干燥时间1~2h，用粉碎机粉碎，过100~400目筛，按料液体积比为1:20~1:30加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.2~1.8mol/L，水浴加热搅拌，用盐酸调节pH。加入复合酶制剂木瓜蛋白酶6~12份，中性蛋白酶5~10份，半胱氨酸0.5~1.2份，亚硫酸钠0.05~0.08份，氯化钙0.2~0.5份，聚谷氨酸0.01~0.02份和甲钴胺0.002~0.005份和助溶剂水杨酸钠4~12份，瓜氨酸0.05~0.08份和氨甲酰磷酸0.008~0.012份。使用上述复合酶制剂酶解缢蛏不仅能得到抗氧化肽，不会破坏抗氧化肽的活性，而且酶解速度快，缩短反应时间。加入助溶剂能抗氧化肽在Tris—HCl缓冲液中溶解度增加，提高抗氧化肽的提取率。酶解温度为50~60℃，pH为6.5~7.2，酶解时间为3~5h，离心取上清液，加入析出剂硫酸铵2~5份，氯化钠1~4份，静置过滤得粗抗氧化肽。上述析出剂能使抗氧化肽分子周围的水化膜减弱或消失，析出率高，而且杂质蛋白质和多肽的析出少；2）超滤：在步骤1得到的抗氧化肽中按体积比1:10~1:15加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.2~1.8mol/L，选用3000~4500Da的超滤膜进行超滤，压力为1000~2000Pa；3）制备缢蛏抗氧化肽：将步骤2得到的超滤液过HPLC柱，固定相为ZrO2/SiO2，流动相为1.2~1.8mol/L的Tris—HCl缓冲液，收集含抗氧化肽的洗脱液，旋转蒸发掉流动相留下缢蛏抗氧化肽固体，冷冻干燥，研磨，得到缢蛏抗氧化肽粉末。上述方法制备的缢蛏抗氧化肽纯度高，活性强，抗氧化作用很好；使用酶解技术制备缢蛏抗氧化肽绿色安全，可放心用于抗氧化保健品或药物的生产。实施例2：一种缢蛏抗氧化肽的制备方法，最优选操作步骤为：1）酶解：将缢蛏用冰水冲洗3次本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缢蛏抗氧化肽的制备方法，其特征在于以下步骤：酶解：将缢蛏清洗干净，干燥，粉碎，加Tris—HCl缓冲液，加热搅拌，加入复合酶制剂和助溶剂，继续搅拌，离心取上清液，加入析出剂，静置过滤得粗抗氧化肽；超滤：在步骤1得到的抗氧化肽中加入Tris—HCl缓冲液，挑选超滤膜进行超滤；制备缢蛏抗氧化肽：将步骤2得到的超滤液过HPLC柱，收集含抗氧化肽的洗脱液，旋转蒸发，冷冻干燥，研磨，得到缢蛏抗氧化肽粉末。

【技术特征摘要】
1.一种缢蛏抗氧化肽的制备方法，其特征在于以下步骤：酶解：将缢蛏清洗干净，干燥，粉碎，加Tris—HCl缓冲液，加热搅拌，加入复合酶制剂和助溶剂，继续搅拌，离心取上清液，加入析出剂，静置过滤得粗抗氧化肽；超滤：在步骤1得到的抗氧化肽中加入Tris—HCl缓冲液，挑选超滤膜进行超滤；制备缢蛏抗氧化肽：将步骤2得到的超滤液过HPLC柱，收集含抗氧化肽的洗脱液，旋转蒸发，冷冻干燥，研磨，得到缢蛏抗氧化肽粉末。2.根据权利要求1所述的一种缢蛏抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述的复合酶制剂成份及其重量份为：木瓜蛋白酶6~12份，中性蛋白酶5~10份，半胱氨酸0.5~1.2份，亚硫酸钠0.05~0.08份，氯化钙0.2~0.5份，聚谷氨酸0.01~0.02份和甲钴胺0.002~0.005份。3.根据权利要求1所述的一种缢蛏抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述的助溶剂成份及其重量份为：水杨酸钠4~12份，瓜氨酸0.05~0.08份和氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄芳芳，余方苗，唐云平，杨最素，丁国芳，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33