应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法，属于生物技术领域。Sso7d是一小段硫磺矿硫化叶菌DNA蛋白。Sso7d与整合酶(IN)融合表达提高IN的溶解性和活性，在纯化过程中无需使用高盐及pH值较高的缓冲液，可以更有效的催化整合体的形成以及与寡核苷酸DNA底物整合的相关过程，与IN相比，3′加工反应活性提高了5倍左右，并在抑制剂筛选过程中提高阳性与阴性值之间的差异。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体地说是将一种新构建的HIV-1整合酶应用于3′加工抑制剂体外筛选方法。
技术介绍
Sso7d有助于稳定DNA双螺旋结构并促使DNA构型转变，Sso7d与IN基因连接，构建出的Sso7d-IN有较好的溶解性和活性。与野生型整合酶不同的是，它可以更有效的催化整合体的形成以及与寡核苷酸DNA底物的相关整合过程，并将其应用于对整合酶3′加工抑制剂的体外筛选。目前应用于整合酶3′加工抑制剂常用筛选的方法有：1.分子信标方法此方法是根据荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)设计出的一段具有茎环结构的寡核苷酸链，两端分别偶联荧光基团和淬灭基团。He根据此原理，设计了38nt的单链DNA底物，退火形成与HIV-1LTRU5相同的序列，在该链的5′端和3′端分别用荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL修饰标记。无IN蛋白存在时，FAM和DABCYL空间距离近时，FAM受激发后发射的荧光被DABCYL吸收淬灭，检测不到荧光信号；加入IN后，整合酶特异性识别3′末端的CAGT序列，切下连有DABCYL的GT二核苷酸，FAM与DABCYL的距离变大，FAM受激发后发射的荧光不再受DABCYL淬灭，激发发射能检测到荧光信号。如抑制剂的抑制效果好，荧光强度降低。本专利技术在此方法基础上，进行改进，不同的是应用Sso7d-IN代替IN，提高反应过程中阳性与阴性值间的差异，有利于抑制剂的筛选。(何红秋.HIV-1整合酶活性检测方法建立和应用研究.北京工业大学博士论文.2010)。2.酶联免疫吸附法此方法利用时间分辨荧光(timeresolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)分析法筛选，该方法的原理是：在合成的一段HIV-1LTRU5端DNA3′端标记生物素，将其包被在微孔板中，加入抑制剂孵育后加入整合酶，将生物素标记的核苷酸被洗掉，加入亲和素偶联的Eu(SA-Eu)，SA-Eu与未剪切的生物素标记的底物序列结合，用时间分辨荧光计可检测荧光信号。加入抑制剂后，荧光强度会增强。(张旋,杨柳萌,郑永唐.HIV-1整合酶抑制剂体外筛选方法研究进展，中国药理学通报，2012，28(1):14-17)。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用一种溶解性和活性更好的整合酶用于3′加工抑制剂的体外筛选，提高了3′加工反应的活性。本专利技术提供的一种应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法，包括以下步骤：(1)HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白及待测化合物样品的制备将合成的Sso7d基因片段与野生型整合酶(integrase,IN)基因分别扩增，通过融合PCR连接，构建Sso7d-IN表达载体，表达并纯化HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白，分装保存待用；室温下将待测化合物样品用二甲基亚砜(DMSO)配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备用；(2)DNA底物的制备用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94℃2min，每90s下降1℃，约2h后，底物会自发形成互补双链。上述退火缓冲液含有10mMTris，50mMNaCl，1mMEDTA，pH＝8.0；DNA底物为5′-(FAM)-ACTGCTAGAGATTTTCCACGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3′-(DABCYL)；(3)待测化合物样品的筛选反应在96孔不透明微孔板中进行，阳性对照组2孔，每孔分别加2μLDMSO，阴性对照组2孔，每孔分别加2μLDMSO，其他实验组各孔加入2μL不同浓度的待测化合物样品；除阴性对照组，其余都加Sso7d-IN；具体操作如下：a、反应体系总体积为100μL，用ddH2O洗板一次，然后每孔加入2×反应缓冲液50μL，加入DTT2μL，2.5μg纯化的HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白；b、然后阳性对照组的孔和阴性对照组的孔分别2μLDMSO，实验组的其他孔加入2μL用DMSO稀释的待测化合物；然后ddH2O补足体积；c、与HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白在无MnCl2的反应缓冲液中37℃孵育30min后，每孔加入终浓度为10mmol/L的Mn2+、20pmolDNA底物，混匀；37℃反应2h，用酶标仪读取荧光读值；d、同样设置了待测化合物与DNA底物组，只加2×反应缓冲液50μL、20pmolDNA底物、2μL用DMSO稀释的待测化合物，37℃孵育2h后用酶标仪读取荧光读值；选择激发光波长为485nm，发射光波长为528nm；上述2×反应缓冲液含有40mMHEPES、200mMNaCl、50％(g/L)甘油，pH＝7.6；(4)按照以下公式计算待测样品的抑制率：通过测定不同浓度下的待测化合物样品抑制率可得出待测化合物的IC50值；由于有些待测化合物样品对DNA荧光基团的RFU值有直接影响，会导致高浓度时待测化合物RFU<阴性对照RFU的情况，因此需要对待测化合物RFU进行修正，用修正后待测化合物RFU带入上面的公式进行计算；在上述步骤d中设置待测化合物样品与DNA底物组，测定化合物不同浓度下，DNA底物RFU值的变化即下述公式中的待测化合物样品与DNA底物组RFU；修正后待测化合物RFU＝待测化合物RFU+(阴性对照RFU－待测化合物样品与DNA底物组RFU)，其中待测化合物RFU指的是步骤c中其他孔的实验组的待测化合物RFU。其中HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白的制备方法进一步如下：(1)将合成的Sso7d片段与IN基因经PCR扩增，得到所需质粒，以Pet-15b载体为基础构建出Sso7d-IN表达载体。转入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆菌接种于5mL含有100mg/mL氨苄的LB液体培养基，37℃摇床振荡培养12-14h得到培养物。(2)将(1)中的培养物按体积比1％接种于LB培养基中，37℃摇床振荡培养2-3h至菌液OD值达到0.6-0.8，加入过滤灭菌的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mM，37℃摇床振荡培养4-5h得到培养物。(3)将(2)中得到的培养物离心得到沉淀，每1g沉淀用10mL裂解缓冲液重悬，加1mg/mL溶菌酶，4℃孵育30min，置于冰浴超声破碎10min，4℃离心收集上清液。上述裂解缓冲液含有20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1MNaCl，5mM咪唑，10％(g/L)甘油，pH＝7.5。(4)将(3)中达到的上清液进行镍琼脂糖凝胶亲和层析本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用Sso7d‑IN融合蛋白进行HIV‑1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法，包括以下步骤：(1)HIV‑1Sso7d‑IN整合酶重组蛋白的制备将合成的Sso7d基因片段与野生型整合酶(integrase,IN)基因分别扩增，通过融合PCR连接，构建Sso7d‑IN表达载体，表达并纯化HIV‑1Sso7d‑IN整合酶重组蛋白，分装保存待用；室温下将待测化合物样品用二甲基亚砜(DMSO)配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备用；(2)DNA底物的制备用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94℃2min，每90s下降1℃，约2h后，底物会自发形成互补双链；上述退火缓冲液含有10mM Tris，50mM NaCl，1mM EDTA，pH＝8.0；DNA底物为5′‑(FAM)‑ACT GCT AGA GAT TTT CCA CGT GGA AAA TCT CTA GCA GT‑3′‑(DABCYL)；(3)待测化合物样品的筛选反应在96孔不透明微孔板中进行，阳性对照组2孔，每孔分别加2μL DMSO，阴性对照组2孔，每孔分别加2μL DMSO，其他孔的实验组中加入2μL不同浓度的待测化合物样品；除阴性对照组，其余都加Sso7d‑IN；具体操作如下：a、反应体系总体积为100μL，用ddH2O洗板一次，然后每孔加入2×反应缓冲液50μL，加入DTT 2μL，2.5μg纯化的Sso7d‑IN整合酶重组蛋白；b、然后阳性对照组的孔和阴性对照组的孔分别2μL DMSO，实验组的其他孔加入2μL用DMSO稀释的待测化合物；然后ddH2O补足体积；c、与HIV‑1Sso7d‑IN整合酶重组蛋白在无MnCl2的反应缓冲液中37℃孵育30min后，每孔加入终浓度为10mmol/L的Mn2+、20pmol DNA底物，混匀；37℃反应2h，用酶标仪读取荧光读值；d、同样设置了待测化合物与DNA底物组，只加2×反应缓冲液50μL、20pmol DNA底物、2μL用DMSO稀释的待测化合物，37℃孵育2h后用酶标仪读取荧光读值；选择激发光波长为485nm，发射光波长为528nm；上述2×反应缓冲液含有40mM HEPES、200mM NaCl、50％(g/L)甘油，pH＝7.6；(4)按照以下公式计算待测样品的抑制率：通过测定不同浓度下的待测化合物样品抑制率可得出待测化合物的IC50值。...
【技术特征摘要】
1.一种应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法，包括以下
步骤：
(1)HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白的制备
将合成的Sso7d基因片段与野生型整合酶(integrase,IN)基因分别扩增，通过融合PCR
连接，构建Sso7d-IN表达载体，表达并纯化HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白，分装保存待用；
室温下将待测化合物样品用二甲基亚砜(DMSO)配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备
用；
(2)DNA底物的制备
用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94℃2min，每90s下降1℃，约2h后，底物
会自发形成互补双链；上述退火缓冲液含有10mMTris，50mMNaCl，1mMEDTA，pH＝8.0；
DNA底物为5′-(FAM)-ACTGCTAGAGATTTTCCACGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3′-
(DABCYL)；
(3)待测化合物样品的筛选
反应在96孔不透明微孔板中进行，阳性对照组2孔，每孔分别加2μLDMSO，阴性对照组2
孔，每孔分别加2μLDMSO，其他孔的实验组中加入2μL不同浓度的待测化合物样品；除阴性
对照组，其余都加Sso7d-IN；具体操作如下：a、反应体系总体积为100μL，用ddH2O洗板一次，
然后每孔加入2×反应缓冲液50μL，加入DTT2μL，2.5μg纯化的Sso7d-IN整合酶重组蛋白；
b、然后阳性对照组的孔和阴性对照组的孔分别2μLDMSO，实验...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡利明，毛志杰，刘伟，剧仑，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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