应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法技术

应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法，属于生物技术领域。Sso7d是一小段硫磺矿硫化叶菌DNA蛋白。Sso7d与整合酶(IN)融合表达提高IN的溶解性和活性，在纯化过程中无需使用高盐及pH值较高的缓冲液，可以更有效的催化整合体的形成以及与寡核苷酸DNA底物整合的相关过程，与IN相比，3′加工反应活性提高了5倍左右，并在抑制剂筛选过程中提高阳性与阴性值之间的差异。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说是将一种新构建的HIV-1整合酶应用于3′加工抑制剂体外筛选方法。
技术介绍
Sso7d有助于稳定DNA双螺旋结构并促使DNA构型转变，Sso7d与IN基因连接，构建出的Sso7d-IN有较好的溶解性和活性。与野生型整合酶不同的是，它可以更有效的催化整合体的形成以及与寡核苷酸DNA底物的相关整合过程，并将其应用于对整合酶3′加工抑制剂的体外筛选。目前应用于整合酶3′加工抑制剂常用筛选的方法有：1.分子信标方法此方法是根据荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)设计出的一段具有茎环结构的寡核苷酸链，两端分别偶联荧光基团和淬灭基团。He根据此原理，设计了38nt的单链DNA底物，退火形成与HIV-1LTRU5相同的序列，在该链的5′端和3′端分别用荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL修饰标记。无IN蛋白存在时，FAM和DABCYL空间距离近时，FAM受激发后发射的荧光被DABCYL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用Sso7d‑IN融合蛋白进行HIV‑1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法，包括以下步骤：(1)HIV‑1Sso7d‑IN整合酶重组蛋白的制备将合成的Sso7d基因片段与野生型整合酶(integrase,IN)基因分别扩增，通过融合PCR连接，构建Sso7d‑IN表达载体，表达并纯化HIV‑1Sso7d‑IN整合酶重组蛋白，分装保存待用；室温下将待测化合物样品用二甲基亚砜(DMSO)配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备用；(2)DNA底物的制备用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94℃2min，每90s下降1℃，约2h后，底物会自发形成互补双链；上述退火缓冲液含有10mM Tri...

【技术特征摘要】
1.一种应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法，包括以下
步骤：
(1)HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白的制备
将合成的Sso7d基因片段与野生型整合酶(integrase,IN)基因分别扩增，通过融合PCR
连接，构建Sso7d-IN表达载体，表达并纯化HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白，分装保存待用；
室温下将待测化合物样品用二甲基亚砜(DMSO)配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备
用；
(2)DNA底物的制备
用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94℃2min，每90s下降1℃，约2h后，底物
会自发形成互补双链；上述退火缓冲液含有10mMTris，50mMNaCl，1mMEDTA，pH＝8.0；
DNA底物为5′-(FAM)-ACTGCTAGAGATTTTCCACGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3′-
(DABCYL)；
(3)待测化合物样品的筛选
反应在96孔不透明微孔板中进行，阳性对照组2孔，每孔分别加2μLDMSO，阴性对照组2
孔，每孔分别加2μLDMSO，其他孔的实验组中加入2μL不同浓度的待测化合物样品；除阴性
对照组，其余都加Sso7d-IN；具体操作如下：a、反应体系总体积为100μL，用ddH2O洗板一次，
然后每孔加入2×反应缓冲液50μL，加入DTT2μL，2.5μg纯化的Sso7d-IN整合酶重组蛋白；
b、然后阳性对照组的孔和阴性对照组的孔分别2μLDMSO，实验...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡利明，毛志杰，刘伟，剧仑，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11