Sirt5，一种线粒体去乙酰化酶，在本发明专利技术中其被鉴定具有脱丙二酰和脱琥珀酰活性。基于Sirt5强的酶活性，本发明专利技术公开了一种鉴定Sirt5调节剂的方法。特异性的Sirt5调节剂可以被用于Sirt5的生物功能的研究，也可以靶向Sirt5活性用于治疗人类疾病。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用美国相关专利申请本专利技术要求美国临时专利申请的优先权(申请号:N0.61/362，078，申请日:2010年7月7日)，在此将其作为参考文献整体引用并到本专利技术中。关于美国联邦资助研究的说明本专利技术得到美国政府的资助，获得NIH基金，合同号为GM086703。因此政府拥有本专利技术的某些权利。
技术介绍
沉默信息调控蛋白2 (Sir2)或者叫去乙酰化酶(Sirtuins)，是一个具有辅酶(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)依赖蛋白去乙酰活性的进化保守的酶家方矣(A.A.Sauve, et al., Annu.Rev.Biochem.75:435 (2006) ；S.-1.1mai, et al., Trendsin Pharmacological Sciences 31:212(2010) ；M.C.Haigis, et al., Annual Reviewof Pathology:Mechanisms of Disease 5:253 (2010)).自从最初发现 sirtuin 的去乙酸活性(S._1.1mai, et al., Nature 403:795 (2000) ；K.G.Tanner, et al., Proc Natl.Acad.Sc1.U.S.A.97:14178 (2000))，揭示了 sirtuins的很多重要的生物功能，并且也很好的理解了 NAD 依赖的去乙酸机制(S.- 1.1mai, et al., Trends in PharmacologicalSciences 31:212 (2010) ；M.C.Haigis, et al., Annual Review of Pathology:Meehanismsof Disease 5:253(2010))。基于序列的相似性，sirtuins被分为不同的类型(R.A.Frye, Biochem, Biophys.Res.Commun.273:793 (2000))。哺乳动物有 7 种 sirtuins,Sirtsl-7。Sirtsl-3属于第一类,Sirt4属于第二类，Sirt5属于第三类，Sirt6和Sirt7属于第四类(R.A.Frye, Biochem.Biophys.Res.Commun.273:793 (2000))。研究sirtuin活性的一个主要障碍在于7种人类sirtuins中的4种(Sirt4_7)要么有非常弱的去乙酰活性，要么没有去乙酰活性(E.Michishita, et al.，Mol.Biol.Cell16:4623 (2005) ；M.C.Haigis et al., Cell 126:941 (2006) ;Α.Schuetz et al., Structure15: 377 (2007) ；G.Liszt, et al., J.Biol.Chem.280:21323(200 5) ；E.Michishita etal., Nature 452:492(2008))。这对研究Sirtuins和开发调节他们活性的小分子带来了许多困难。比如，由于没有强活性检测方法，所以难以开发以Sirts4-7为靶点的抑制剂或激活剂。也难以确认以Sirtl、Sirt2和Sirt3为靶点的抑制剂或激活剂是否也同样作用于Sirts4_70专利技术概沭Sirt5，一种线粒体去乙酰化酶，被发现是一种有效的脱丙二酰和脱琥珀酰酶。这个发现证明了哺乳动物线粒体蛋白新的翻译后进行修饰的过程，即赖氨酸残基的丙二酰化和琥珀酰化。Sirt5去除线粒体蛋白赖氨酸残基上的戊二酰，丙二酰和琥珀酰基团，这个过程被认为可以可逆的调节线粒体蛋白的活性。由于发现了这个强酶活性，使得能够开发识别Sirt5调节剂的方法。Sirt5特异性的调节剂可被用于研究Sirt5的生物功能和革巴向Sirt5活性用于治疗人类疾病。附图简沭附图说明图1:使用AMC-琥珀酰肽来测试Sirt5的荧光实验。图2A-2D:Sirt5的结构揭示了一个不寻常的酰基袋。(A)Sirt5的酰基袋被CHES的缓冲分子与Argl05和Tyrl02相互作用产生的硫酸盐部分占据。所述硫酸酯距离硫代乙酰基团4.2A, (B)Sirt5-硫代乙酰肽结构和Sir2Tm-乙酰肽结构的对比。(C)理论预测丙二酰/琥珀酰肽可能是Sirt5更好的底物。(D) Sirt5-琥珀酰肽-NAD三重结构表明琥珀酰基团和Tyrl02和Argl05的相互作用。图3A-3F:Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰赖氨酸的水解。纯化的去乙酰化酶(Sirtl0.75μΜ或Sirt53.3μΜ)和0.3mM的酰基肽一起孵育，1.0mM NAD加到含有ImM DTT的60 μ L的20mM Tris-HCl缓冲液中(ρΗ7.5)，在37°C反应2小时。反应用60 μ L10%TFA终止。去除沉淀的蛋白后，使用LCMS分析反应混合物。灰色曲线表明酰基肽的质量(乙酰肽，m/zl274.0 ;丙二酰肽，m/zl318.0 ;琥珀酰肽，m/zl332.0)和脱乙酰肽的质量(m/zl232.0)的离子峰强度(IOx放大)。黑色曲线表明所有从100-2000的质量(总离子数或者TIC)的离子峰强度。对于Sirtl，当H3K9乙酰肽(A)作为底物时可检测出脱乙酰产物，当使用H3K9丙二酰(B)和琥珀酰(C)肽时没有水解产物被检出。对于Sirt5，脱乙酰产物很少被检出(D)，而脱丙二酰(E)和脱琥珀酰(F)产物可以被检出。图4A-4B:㈧琥珀酰赖氨酸残基存在于牛肝脏线粒体中。使用32P-NAD可以检出Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰肽的水解，形成32P标记的O-Ma-ADPR(条带2)和O-Su-ADPR(条带3)。用乙酰肽则没有反应发生(条带I)。当组蛋白被用作乙酰赖氨酸(条带8)或H3K9乙酰肽(条带4)的来源时，Sirtl催化的O-Ac-ADPR的形成可以被检测出来。当用32P-NAD和Sirt5孵育被胰蛋白酶消化的牛肝脏线粒体肽时形成O-Su-ADPR(条带9)，但用Sirtl则不能形成(条带10)，这表明琥珀酰赖氨酸残基存在于牛肝脏线粒体肽提取物中。作为对照组的用BSA肽和Sirt5的反应不会产生0-Su-ADPR(条带12)。⑶38能水解NAD产生ADPR，它被用来产生在第13条带上的标准32P-ADPR点。(B) Sirt5的缺失可以增加老鼠肝脏部位的C PSl琥珀酰水平。在野生型或Sirt5敲除的肝脏中免疫沉淀出CPS1，用32P-NAD检测出琥珀酰化水平。合成的乙酰，丙二酰和琥珀酰肽可被用来分别产生对照点 0-Ac-ADPR，O-Ma-ADPR 和 O-Su-ADPR。图5A-5C =Sirtl和Sirt5催化的H3K9肽(A)脱乙酰化，⑶脱丙二酰化和(C)脱琥珀酰化通过HPLC被检测(检测波长为215nm)。一个更长的HPLC柱被用于更好地分离酰基肽和脱酰基肽。结果进一步表明Sirtl有更好的脱乙酰活性，而Sirt5有更好的脱丙二酰和脱琥珀酰活性。图6A-6B: (A)表示Sirtuin催化的NAD依赖的脱酰基化反应，这个反应产生O-酰基-ADP-核糖。(B) sirtuin催化的NA本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.07 US 61/362,0781.一种识别Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的调节剂的方法，包括: 提供候选化合物； 提供底物，所述底物包含与指示剂部分连接的丙二酰或琥珀酰赖氨酸； 在上述候选药物存在的情况下，将底物和Sirt5接触，使底物被Sirt5脱丙二酰和脱琥珀酰化； 用裂解剂接触所述脱丙二酰化或脱琥珀酰化的底物，所述裂解剂裂解所述赖氨酸和所述指示剂部分间的连接，以释放出所述指示剂部分，从而产生可检测的信号；以及 建立信号强度和Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性间的相关性；其中，存在所述候选化合物时Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性相对于不存在所述候选化合物情况时Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的变化将所述候选化合物识别为Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的调节剂。2.按权利要求1所述的方法，其中所述底物是肽，所述肽包含丙二酰或琥珀酰赖氨酸，所述丙二酰或琥珀酰赖氨酸通过肽键与所述指示剂部分共价连接。3.按权利要求2所述的方法，其中所述裂解剂是蛋白水解酶。4.按权利要求3所述的方法，其中所述蛋白水解酶是胰蛋白酶。5.按权利要求1所述的方法，其中所述指示剂部分有荧光性质。6.按权利要求5所述的方法，其中所述指示剂部分包含荧光团，所述荧光团在指示剂部分被裂解和释放时会改变其发射波长。7.按权利要求5所述的方法，其中所述指示剂部分包含荧光团，并且所述底物也用淬火基团标记，当所述指示剂部分从底物上裂解时，其会产生荧光信号。8.按权利要求5所述的方法，其中所述指示剂部分包含荧光团，所述荧光团是供体-受体荧光团对中的一个，并且所述荧光团对中的一个和赖氨酸残基的羧基末端相连，另一个直接或间接地和赖氨酸残基的氨基末端相连。9.按权利要求8所述的方法，其中所述指示剂荧光团从底物上裂解时会减弱基于荧光共振能量转移(FRET)的信号强度。10.按权利要求5所述的方法，其中所述指示剂部分是7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)。11.按权利要求10所述的方法，其中所述底物是ISGASE(SuK)-AMC(SEQ ID NO: 11)。12.按权利要求1所述的方法，其中所述候选化合物是小分子。13.按权利要求12所述的方法，其中所述候选化合物具有下式:14.按权利要求1所述的方法，进一步包括检测候选分子影响Sirtl、2、或3中任何一个的脱乙酰活性的能力。15.一种识别或测定Sirt5脱...
【专利技术属性】
技术研发人员：林合宁，
申请(专利权)人：康奈尔大学，
类型：
国别省市：
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