藻类细胞的制备方法以及化学物质的毒性评价用试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种藻类细胞的制备方法，用于利用延迟发光来评价化学物质的毒性，其中包括使对数生长期的藻类细胞冷冻的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及藻类细胞的制备方法以及化学物质的毒性评价用试剂盒。
技术介绍
在使用藻类的评价化学物质的毒性的情况下，必须以用液体培养或用琼脂培养基等进行维持的细胞为基础实施原代培养(primary culture)以及继代培养(subculture)并制备藻类细胞，并将被检物质添加到制备好的藻类细胞中来进行试验。但是，维持藻类细胞或者每个试验中进行继代培养都很麻烦而不便。为了消除这种麻烦，可以利用冷冻了的藻类细胞(非专利文献I以及2等)。通过就在试验之前解冻已冷冻了的藻类细胞并利用解冻了的藻类细胞，从而可以不对藻类细胞实施继代培养而能够迅速地提供给试·验。现有技术文献专利文献专利文献1:国际公开第2005/062027号非专利文献非专利文献1:桑野和可，2002年《藻类的冷冻保存》；堀辉三 大野正夫 堀口健雄编“21世纪初的藻学的现状”；日本藻类学会，山形，108 111页非专利文献2:森史等，“国立环境研究所微生物系统保存设施之蓝藻和绿藻的冷冻保存”，Microbiol.Cult.Coll.，2002 年 6 月，45-55 页非专利文献3 J.G.Day等，“藻类的超低温保存”，分子生物学方法，38卷，冷冻保存与冷冻干燥实验指南，81-89页
技术实现思路
专利技术所要解决的技术问题作为冷冻的藻类细胞，通常使用稳定期的细胞。这是因为能够减少解冻而制备成具有生存能力的细胞的时间，而且脂质等细胞内物质作为细胞保护剂进行工作(非专利文献3)。在使用藻类的评价化学物质的毒性的方法中，作为较经济合作与发展组织(OECD)测试指南TG201所规定的抑制生长试验更迅速并且更简便的方法，本专利技术人已经开发了利用藻类的延迟发光的方法(专利文献I)。然而，本专利技术人发现:如果冷冻稳定期的藻类细胞并解冻来进行培养的话，则与冷冻前的细胞相比较生长会变得不良。细胞的生长会影响到利用延迟发光的毒性评价，所以如果使用稳定期的藻类细胞作为冷冻的藻类细胞的话，则会产生不能够进行与使用冷冻前的藻类细胞的情况相同等的毒性评价的问题。因此，有必要制备解冻后的生长良好的藻类的冷冻细胞。解决技术问题的手段本专利技术人为了解决上述技术问题反复作了悉心研究，发现:通过使用对数生长期(logarithmic growth phase)的细胞作为冷冻的藻类细胞,解冻后的藻类细胞能够顺利地进行繁殖，以至于完成了本专利技术。S卩，本专利技术提供一种用于利用延迟发光进行的化学物质的毒性评价的藻类细胞的制备方法，其中包括使对数生长期的藻类细胞冷冻的工序。如果使对数生长期的藻类细胞冷冻，则解冻后的藻类细胞的生长将变得良好，并且能够获得与冷冻前同等强度的延迟发光的发光量。优选相对于冷冻的藻类细胞的总数，50%以上的藻类细胞具有4.以上的粒径。另外，优选冷冻的藻类细胞的粒径分布曲线显示双峰分布。通过使用像这样的藻类细胞，解冻后的藻类细胞的生长将变得更为良好，对于延迟发光来说也将变得容易获得与冷冻前同等的强度的发光量。另外，优选在使用以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata)作为冷冻的藻类细胞的情况下，相对于所冷冻的藻类细胞总数，55%以上的藻类细胞具有显示双峰分布的粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径。另外，优选在使用以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻的情况下，相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，显示双峰分布的粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为50%以上。在使用以株号NIES-35被保存的绿藻的情况下，通过使用如以上所述的粒径分布的藻类细胞，解冻后的藻类细胞的生长将变得更为良好。另外，优选在使用以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)中的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata)作为冷冻的藻类细胞的情况下，相对于冷冻的藻类细胞的总数，46%以上的藻类细胞具有显示双峰分布的粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径。另外，优选在使用以ATCC编号22662被保存于美国典 型培养物保藏中心的绿藻的情况下，相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，显示双峰分布的粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为37%以上。在使用以ATCC编号22662被保存的绿藻的情况下，通过使用如以上所述的粒径分布的藻类细胞，解冻后的藻类细胞的生长将变得更为良好。另外，本专利技术的方法优选在使对数生长期的藻类细胞冷冻的工序之前，进一步包括:在培养液中培养对数生长期的藻类细胞的工序，离心分离含有该藻类细胞的培养液的工序，以及从藻类细胞中完全除去由离心分离分离出的培养上清液的工序。通过从藻类细胞中完全除去培养上清液，从而减少冷冻、解冻对延迟发光图形的影响，并且容易获得与冷冻前的细胞同等的延迟发光图形。再有，本专利技术的方法优选包括在-80°C以下的温度下维持被冷冻的所述对数生长期的藻类细胞的工序。通过在_80°C以下的温度下进行维持，从而就能够防止冷冻中的细胞发生损伤，并且冷冻后的藻类细胞的生长将变得更为良好。另外，本专利技术是提供一种包含被冷冻的对数生长期的细胞的利用延迟发光的化学物质毒性评价用的试剂盒。通过使用这样的试剂盒，从而就能够简易而且迅速地进行利用延迟发光的化学物质的毒性评价。优选相对于所述被冷冻的藻类细胞的总数，50%以上的藻类细胞具有4.5 y m以上的粒径，另外，优选藻类细胞的粒径分布曲线显示双峰分布。另外，优选包含于上述毒性评价试剂盒中的被冷冻的藻类细胞是以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata),相对于被冷冻的藻类细胞总数，55%以上的藻类细胞具有显示双峰分布的粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径，优选相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，显示双峰分布的粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为50%以上。另外，优选包含于上述毒性评价试剂盒中的被冷冻的藻类细胞是以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata),相对于被冷冻的藻类细胞的总数，46%以上的藻类细胞具有显示双峰分布的粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径，优选相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，显示双峰分布的粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为37%以上。另外，包含于上述毒性评价试剂盒中的被冷冻的藻类细胞优选由包括以下工序的方法进行制备:在培养液中培养对数生长期的藻类细胞的工序，离心分离含有该藻类细胞的培养液的工序，从藻类细胞中完全除去由离心分离分离出的培养上清液的工序，以及冷冻余下的藻类细胞的工序。另外，包含于上述毒性评价试剂盒中的藻类细胞优选在-80°C以下的温度下被维持。专利技术的效果根据本专利技术的藻类细胞的制备方法，因为冷冻以及解冻之后的藻类细胞的繁殖良好，所以在进行利用延迟发光的化学物质的毒性评价的时候，能够与冷冻前的藻类细胞同样地进行使用。再有，根据本专利技术的利用延迟发光的化学物质的毒性评价用试剂盒，能够简易而且迅速地进行化学本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.08 JP 2010-2011421.一种藻类细胞的制备方法，其特征在于: 用于利用延迟发光来评价化学物质的毒性， 包括使对数生长期的藻类细胞冷冻的工序。2.按权利要求1所述的方法，其特征在于: 相对于所述冷冻的藻类细胞的总数，50%以上的藻类细胞具有4.5 y m以上的粒径。3.按权利要求1或者2所述的方法，其特征在于: 所述冷冻的藻类细 胞的粒径分布曲线显示双峰分布。4.按权利要求3所述的方法，其特征在于: 所述所冷冻的藻类细胞是以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于所述冷冻的藻类细胞的总数，55%以上的藻类细胞具有所述粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径。5.按权利要求3或者4所述的方法，其特征在于: 所述冷冻的藻类细胞是以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，所述粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为50%以上。6.按权利要求3所述的方法，其特征在于: 所述冷冻的藻类细胞是以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于所述冷冻的藻类细胞总数，46%以上的藻类细胞具有所述粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径。7.按权利要求3或者6所述的方法，其特征在于: 所述冷冻的藻类细胞是以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，所述粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为37%以上。8.按权利要求1 7中的任意一项所述的方法，其特征在于: 在使所述对数生长期的藻类细胞冷冻的工序之前，进一步包括: 在培养液中培养所述对数生长期的藻类细胞的工序， 离心分离含有所述藻类细胞的所述培养液的工序，以及 从所述藻类细胞中完全除去由所述离心分离所分离出的培养上清液的工序。9.按权利要求1 8中的任意一项所述的方法，其特征在于: 进一步包括在_80°C以下的温度下维持被冷冻的所述对数生长期...

【专利技术属性】
技术研发人员：数村公子，竹内彩乃，胜又政和，
申请(专利权)人：浜松光子学株式会社，
类型：
国别省市：