一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及药物检测技术领域，特别涉及一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒。该方法包括：将P815细胞接种于培养基中；在培养基中加入待测物及与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子，检测IP1和/或cAMP的浓度；根据IP1和/或cAMP的浓度，确认待测物是否为引起类过敏反应的物质。本发明专利技术提供的检测方法结果准确可靠，与传统的β‑氨基己糖苷酶释放率实验检测结果基本一致，但灵敏度比β‑氨基己糖苷酶释放率检测方法要高；本发明专利技术的检测方法简便易行、快速，克服了传统方法的不足，可应用于引起类过敏反应的物质的早期快速筛查及鉴定，具有广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物检测
，特别涉及一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒。
技术介绍
过敏反应即变态反应，是外源性抗原物质与体内抗体间所发生的一种非正常的免疫反应，为常见的不良反应之一。可以诱发过敏反应的物质很多，如具有完全抗原性的蛋白质、多肽、多糖等大分子物质；另一些分子较小的化合物可作为半抗原与体内蛋白质结合成完全抗原，从而引起过敏反应。目前涉及到过敏反应的过敏物质很多，发生频率较高的有药品(中药及西药)、食品、花粉、螨虫等。急性过敏反应包括I型超敏反应和类过敏反应。最新调查研究表明，77％的急性过敏反应为类过敏反应，类过敏反应发生率远高于I型超敏反应。类过敏反应无需IgE介导，首次接触药物即可出现过敏症状，给人类的生活带来极大的危害。鉴于类过敏反应的危害性，尤其在医药领域中的频繁发生，如中药注射液的过敏反应，使人们越来越意识到早期预防的重要性。其中，致敏原物质的早期快速检测是降低类过敏反应的重要手段。肥大细胞是诱发类过敏反应的中心枢纽，它在受抗原刺激后脱颗粒直接导致一系列过敏症状的产生。目前，常用的体外检测肥大细胞脱颗粒的方法主要有β-氨基己糖苷酶法、类胰蛋白酶法、组胺法、扫描及透射电镜等。这些方法经典稳定，但都有各自的局限性。为了检测相应指标，肥大细胞经过各种化学固定及显色处理，失去了活体状态下脱颗粒的一系列生物信息，由此也引起很多检测误差，也无法进行精确定量及动态观察。因此，如何准确检测类过敏原成为了新的研究方向。研究发现在肥大细胞脱颗粒的过程中，钙离子和环磷腺苷的升高是活性介质释放的前提条件，这种现象在1973年就被发现，但真正将钙离子和环磷腺苷的活体动态监测作为评价指标，应用于类过敏原的早期快速评估尚没有人尝试。专利号为CN102154434B的专利中提出，用钙流检测方法确认物质的过敏性，可以对致敏原进行筛选。但钙流方法只适用于贴壁细胞的检测，若使用悬浮或半悬浮细胞，会使得检测数据不真实，不稳定。同时，钙流检测只能针对与受体快速结合并发挥作用的化合物，不适合反应较慢的化合物。因此，需要提供一种新型的检测引起类过敏反应的物质的方法及试剂盒。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒。该检测方法结果准确可靠，与传统的β-氨基己糖苷酶释放率实验检测结果基本一致，但灵敏度比β-氨基己糖苷酶释放率检测方法要高；本专利技术的检测方法简便易行、快速，克服了传统方法的不足，可应用于引起类过敏反应的物质的早期快速筛查及鉴定，具有广泛的应用价值。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种检测引起类过敏反应的物质的方法，包括如下步骤：步骤a：将P815细胞接种于培养基中；步骤b：在培养基中加入待测物及与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子，检测IP1和/或cAMP的浓度；步骤c：根据IP1和/或cAMP的浓度，确认待测物是否为引起类过敏反应的物质。在本专利技术中，应用P815细胞进行实验，使用1-磷酸肌醇(IP1)来替代钙流的检测来确认物质的过敏性。IP1检测反映的是第二信使1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)的含量，当样品中加入LiCl后，IP1不再代谢，而是蓄积在细胞内。随着细胞内产生的IP1增多，游离的IP1与抗体结合增多，信号逐渐减弱。本专利技术建立了一种简便易行、可靠的、通过检测肥大细胞内IP1和cAMP变化来反映其脱颗粒状况的方法，并通过与传统方法对应比较，以C48/80为阳性药物，对临床不同种类的中药注射液进行了实际应用，充分说明了本方法的快速、灵敏性及可靠性。该方法克服了传统方法的不足，可应用于类过敏原的早期快速筛查及鉴定，具有广泛的应用价值。在本专利技术提供的实施例中，步骤b中生物分子为抗体。作为优选，步骤b中检测IP1和/或cAMP的浓度采用的试剂为基于HTRF技术的IP1检测试剂和/或cAMP检测试剂。作为优选，P815细胞为对数生长期的P815细胞。作为优选，待测物为药物或螨。在本专利技术提供的实施例中，待测物为药物注射剂。在本专利技术提供的实施例中，待测物为中药注射剂。在本专利技术提供的实施例中，待测物选自参麦注射液、注射用血塞通、脉络宁注射液、舒血宁、痰热清注射液或热毒宁注射液。本专利技术还提供了一种检测引起类过敏反应的物质的试剂盒，包括：与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子。作为优选，生物分子为抗体。在本专利技术提供的实施例中，与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子为IP1抗体和/或cAMP抗体。作为优选，与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子为经过标记的生物分子。通过标记读取信号获得目标物质的浓度。在本专利技术的实施例中，检测IP1和/或cAMP的浓度的试剂为基于HTRF技术的IP1检测试剂或cAMP检测试剂。在本专利技术中，应用HTRF技术的IP1和cAMP检测试剂盒，在活体状态下动态监测在致敏原物质刺激下P815细胞内IP1和cAMP的变化，以变化程度作为类过敏反应判定的标准。该方法在活细胞状态下，灵敏、快速对致敏原进行筛选，克服了原有方法的不足，在类过敏反应发生的早期即可发现潜在威胁，将为过敏原过敏性筛查、过敏原检测、环境安全性监测等领域提供新的方法。本专利技术提供了一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒。该方法包括：将P815细胞接种于培养基中；在培养基中加入待测物及与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子，检测IP1和/或cAMP的浓度；根据IP1和/或cAMP的浓度，确认待测物是否为引起类过敏反应的物质。本专利技术至少具有如下优势之一：1、本专利技术提供的检测方法结果准确可靠，与传统的β-氨基己糖苷酶释放率实验检测结果基本一致，克服了传统方法的不足，可应用于引起类过敏反应的物质的早期快速筛查及鉴定，具有广泛的应用价值；2、本专利技术提供的检测方法的灵敏度比β-氨基己糖苷酶释放率检测方法要高；3、本专利技术的检测方法简便易行、快速；4、本专利技术检测方法适用于贴壁细胞的检测，也适用于悬浮或半悬浮细胞的检测；5、本专利技术检测方法适合于类过敏反应较慢的化合物的检测。附图说明图1示IP1的标准曲线；图2示cAMP的标准曲线。具体实施方式本专利技术公开了一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒中所用生物材料、试剂、仪器均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1实验方法：1.材料试剂：RPMI1640培养基(GIBCO)；胎牛血清(Gibco)，cAMPdynamic2kit(cisbio)，IP1Tbkit(cisbio)，384孔板(Corning)，Compound48/80(Sigma，美国)，β-D-氨基葡萄糖胺(Sigma)，参麦注射液(河北神威药业有限公司，批号：1401192)，注射用血塞通(黑龙江省珍宝岛药业股份有限公本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测引起类过敏反应的物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a：将P815细胞接种于培养基中；步骤b：在所述培养基中加入待测物及与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子，检测IP1和/或cAMP的浓度；步骤c：根据IP1和/或cAMP的浓度，确认所述待测物是否为引起类过敏反应的物质。

【技术特征摘要】
1.一种检测引起类过敏反应的物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a：将P815细胞接种于培养基中；步骤b：在所述培养基中加入待测物及与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子，检测IP1和/或cAMP的浓度；步骤c：根据IP1和/或cAMP的浓度，确认所述待测物是否为引起类过敏反应的物质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述生物分子为抗体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤b中所述检测IP1和/或cAMP的浓度采用的试剂为基于HTRF技术的IP1检测试剂和/或cAMP检测试剂。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：萧伟，江益平，吴秀，曹亮，丁岗，王振中，
申请(专利权)人：江苏康缘药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32