用斑马鱼鳔损伤炎症模型评价肺损伤治疗剂与诱导剂的方法技术

本发明专利技术提供了斑马鱼鳔损伤炎症模型的建立方法，以及应用该斑马鱼鳔损伤炎症模型评价肺损伤治疗剂与诱导剂功效的方法。本发明专利技术提供的斑马鱼鳔损伤炎症模型，具有简便、快速、经济、高效、高通量等优点；能准确反映肺损伤治疗机或诱导剂在体内的真实情况，可实现在体内高通量评价药物对治疗急性肺损伤炎症的功效，其评价药物功效的方法具有可靠、快速、高效、低廉、高性价比等优点，意义重大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药物评价与筛选的
，具体涉及一种简便、经济、高通量的斑马鱼鳔损伤炎症模型的应用，尤其是用该斑马鱼模型评价肺损伤治疗剂功效与诱导剂毒性的方法。
技术介绍
急慢性肺疾病，特别是肺损伤、肺部炎症、肺部肿瘤是严重危害人来健康的疾病之一。大气细颗粒物(PM2.5)、吸烟、放射、化疗等物理化学因素是引起急慢性肺损伤和肺癌的危险因素，其中PM2.5/吸烟等原因引起的慢性阻塞性肺损伤是一种不完全可逆的、对有害颗粒和气体产生异常炎症应答的、气流限制性呼吸系统疾病，可增加肺癌发生的风险，现今成为发病率较高的疾病之一。世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)报告指出，在全球范围内，空气污染导致了5％的气管癌、支气管癌和肺癌的发生，2％的心肺死亡率，以及1％呼吸系统感染的死亡率，相当于80万人死亡和790万人肺损伤。PM2.5表面吸附了大量有毒有害物质，可通过呼吸而沉积在肺泡，引起肺损伤。世界卫生组织、美国环境保护署等诸多机构已经公布PM2.5是对人体健康危害最大且代表性最强的大气污染物。目前肺损伤的治疗主要有：通气供氧、选用抗生素、糖皮质激素、外源性肺表面活性物质、血管扩张剂、相关酶等。但现有的肺损伤治疗药物存在着或疗效不佳，或毒副作用较大或费用高等问题，因此开发新的肺损伤治疗药物显得非常必要[1-2]。药物筛选是发现、开发药物过程中一个重要的环节，实验肺损伤模型的建立对评价与筛选肺损伤治疗药物至关重要。目前肺损伤动物模型主要被用来研究肺损伤的机制，但这些动物模型大多数是根据已知的诱发肺损伤的危险因子复制的，例如脓毒血症、继发于骨折的脂肪栓塞、吸入酸性物质、肺或末端血管床的缺血-再灌注以及其他的临床危险因素，但所有这些模型都不可能完全充分复制人类肺损伤的特征。理想的肺损伤实验动物模型应能够复制人类肺损伤发生的机制和后果。但是目前为止没有任何一个实验动物模型可以完全复制人类肺损伤的所有特征，大多肺损伤实验动物模型只是针对人类肺损伤的单个或少数几个病理生理特征进行复制，如换气功能异常、肺顺应性下降、肺实质损伤和肺泡毛细血管膜通透性增加等，并且这些动物模型均存在造模操作复杂、技术要求高、手术创伤大、肺损伤发生率低、并发症和死亡率高、模型建立不稳定、可重复性差等缺点[3-4]，不利于后续肺损伤治疗药物的评价与筛选工作，且实验周期长、费用高、工作量大。体外细胞模型缺少药物在生物整体的代谢转化和体内的循环分布，不能反映药物在体内的真实情况。因此建立一种能很好的模拟药物在体内的过程，又能快速方便的评价与筛选肺损伤治疗药物的动物模型具有重要的应用价值。肺泡作为一个基本单元，对外界致病菌的攻击更为敏感[5]，细菌和病毒对肺泡感染以及进入肺泡的污染空气中的颗粒均可引起ALI/ARDS疾病[6-8]，而肺泡被感染后，会引起中性粒细胞的聚集，随后中性粒细胞会释放颗粒蛋白或活性氧簇(ROS)等物质[9]，这些物质会进一步加快ALI/ARDS的进程。研究发现，在动物急性肺损伤疾病模型中，通过干扰中性粒细胞趋化、迁移、粘附和细胞渗出等行为，可以缓解动物的病情进展[10-12]。目前对急性肺损伤的研究虽已有几十年的历史，但对于中性粒细胞在急性肺损伤进程中浸润的机理尚不明确，但在某种程度上，主要是因为动物模型无法为研究者提供对肺泡中性粒细胞行为进行动态观察的便利条件[13]。斑马鱼是一种新颖的脊椎模式动物，与人类基因同源性高达85％，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，具有体积小(可用微孔板分析)、发育周期短、体外受精、透明(可直接用肉眼和解剖显微镜观察)、单次产卵数较高等特点[14]。斑马鱼模型既具有体外实验快速、高效、低廉、用药量小等优势，又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高、可观察多个器官等优点，近年已在化合物药效、毒性评价中得到广泛应用[15,16]。鱼鳔作为鱼类浮力调节的重要器官，已经被大量的研究在解剖学[20]、形态学[21]和转录组学[22]等不同水平证实同陆生动物的肺为同源器官。2013和2014年，Cass和Robertson等分别在斑马鱼鳔上检测到了肺表面活性物质[21,23]；虽然已经有文献报道，斑马鱼鳔可以应用于一些人类疾病的基础研究，比如2013年，Gratacap等人通过研究斑马鱼对鳔念珠菌感染鱼鳔后的反应，探究了白色念珠菌、上皮细胞与免疫细胞三者之间的交互关系；2015年Voelz等人通过斑马鱼对毛霉菌孢子感染斑马鱼后脑室和鳔后的反应，探索了毛霉菌孢子与机体免疫系统的交互作用；然而，迄今为止，用斑马鱼鳔作为动物模型开展肺疾病研究的相关文献尚未见报道。故，目前评价肺损伤治疗剂与诱导剂的方法，仍旧是基于传统的实验动物模型(如鼠类、犬类等)，尚未见有基于斑马鱼鳔损伤炎症模型进行药物评价的文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种斑马鱼鳔损伤炎症模型的建立方法，同时提供一种利用该模型评价肺损伤治疗剂与诱导剂功效的方法。本专利技术提供的方法具有简便、快速、经济、高效、高通量等优点。为实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：内容一：一种斑马鱼鳔损伤炎症模型的建立方法，包括如下步骤：(1)斑马鱼最佳发育阶段的确定取4～5对中性粒细胞绿色荧光转基因品系斑马鱼(MPO)亲本交配，按照Westerfield[26]的方法孵化胚胎；选择不同发育阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼；根据不同的发育阶段将对应的微孔板均设为3个实验组：1个为诱导剂处理组，该组中对斑马鱼鳔腔注射单浓度的诱导剂；1个为溶剂处理组，该组中对斑马鱼鳔腔注射等体积的PBS；1个为空白对照组，该组中对斑马鱼不进行任何处理；然后，各实验组均加入相同体积的养鱼用水，在相同温度下恒温培养；当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，用立体荧光显微镜对斑马鱼鳔位置拍照并保存，对斑马鱼鳔位置聚集的中性粒细胞数量进行定性和定量评价，确定斑马鱼的最佳发育阶段；所述不同发育阶段的斑马鱼为4.5～6dpf的斑马鱼；所述最佳发育阶段的斑马鱼为5dpf的斑马鱼；(2)诱导剂最佳给药浓度的确定取5dpf的斑马鱼移入微孔板；设置空白对照组、溶剂注射组和不同给药浓度的诱导剂处理组：空白对照组对斑马鱼不进行任何处理，溶剂注射组对斑马鱼鳔腔注射PBS，诱导剂处理组对斑马鱼鳔腔分别注射等体积但不同给药浓度的诱导剂；然后，各实验组均加入相同体积的养殖用水，在相同温度下恒温培养；当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，用立体荧光显微镜对斑马鱼鳔位置拍照并保存，对斑马鱼鳔位置聚集的中性粒细胞数量进行定性和定量评价，确定诱导剂的最佳给药浓度；所述诱导剂的给药浓度为1～10mg/mL，所述诱导剂的最佳给药浓度为10mg/mL；(3)构建斑马鱼鳔损伤炎症模型取5dpf的斑马鱼移入微孔板；设置3个实验组：1个为诱导剂处理组，该组中对斑马鱼鳔腔注射10mg/mL的诱导剂，1个为溶剂注射组，该组中对斑马鱼鳔腔注射等体积的PBS；然后，各实验组均加入相同体积的养殖用水，在相同温度下恒温培养；当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，用立体荧光显微镜对斑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种斑马鱼鳔损伤炎症模型的建立方法，包括如下步骤：(1)斑马鱼最佳发育阶段的确定取中性粒细胞绿色荧光转基因品系斑马鱼亲本交配、孵化，选择不同发育阶段的斑马鱼分别移入微孔板；根据不同的发育阶段将对应的微孔板均设为3个实验组：1个为诱导剂处理组，该组中对斑马鱼鳔腔注射单浓度的诱导剂；1个为溶剂处理组，该组中对斑马鱼鳔腔注射等体积的PBS；1个为空白对照组，该组中对斑马鱼不进行任何处理；然后，各实验组均加入相同体积的养鱼用水，在相同温度下恒温培养；当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，用立体荧光显微镜对斑马鱼鳔位置拍照并保存，对斑马鱼鳔位置聚集的中性粒细胞数量进行定性和定量评价，确定斑马鱼的最佳发育阶段；所述不同发育阶段的斑马鱼为4.5～6dpf的斑马鱼；所述最佳发育阶段的斑马鱼为5dpf的斑马鱼；(2)诱导剂最佳给药浓度的确定取5dpf的斑马鱼移入微孔板；设置空白对照组、溶剂注射组和不同给药浓度的诱导剂处理组：空白对照组对斑马鱼不进行任何处理，溶剂注射组对斑马鱼鳔腔注射PBS，诱导剂处理组对斑马鱼鳔腔分别注射等体积但不同给药浓度的诱导剂；然后，各实验组均加入相同体积的养殖用水，在相同温度下恒温培养；当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，用立体荧光显微镜对斑马鱼鳔位置拍照并保存，对斑马鱼鳔位置聚集的中性粒细胞数量进行定性和定量评价，确定诱导剂的最佳给药浓度；所述诱导剂的给药浓度为1～10mg/mL，所述诱导剂的最佳给药浓度为10mg/mL；(3)构建斑马鱼鳔损伤炎症模型取5dpf的斑马鱼移入微孔板；设置3个实验组：1个为诱导剂处理组，该组中对斑马鱼鳔腔注射10mg/mL的诱导剂，1个为溶剂注射组，该组中对斑马鱼鳔腔注射等体积的PBS；然后，各实验组均加入相同体积的养殖用水，在相同温度下恒温培养；当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，用立体荧光显微镜对斑马鱼鳔位置拍照并保存，对斑马鱼鳔位置聚集的中性粒细胞数量进行统计分析，根据统计学结果，判断已建立了斑马鱼鳔损伤炎症模型。...

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼鳔损伤炎症模型的建立方法，包括如下步骤：(1)斑马鱼最佳发育阶段的确定取中性粒细胞绿色荧光转基因品系斑马鱼亲本交配、孵化，选择不同发育阶段的斑马鱼分别移入微孔板；根据不同的发育阶段将对应的微孔板均设为3个实验组：1个为诱导剂处理组，该组中对斑马鱼鳔腔注射单浓度的诱导剂；1个为溶剂处理组，该组中对斑马鱼鳔腔注射等体积的PBS；1个为空白对照组，该组中对斑马鱼不进行任何处理；然后，各实验组均加入相同体积的养鱼用水，在相同温度下恒温培养；当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，用立体荧光显微镜对斑马鱼鳔位置拍照并保存，对斑马鱼鳔位置聚集的中性粒细胞数量进行定性和定量评价，确定斑马鱼的最佳发育阶段；所述不同发育阶段的斑马鱼为4.5～6dpf的斑马鱼；所述最佳发育阶段的斑马鱼为5dpf的斑马鱼；(2)诱导剂最佳给药浓度的确定取5dpf的斑马鱼移入微孔板；设置空白对照组、溶剂注射组和不同给药浓度的诱导剂处理组：空白对照组对斑马鱼不进行任何处理，溶剂注射组对斑马鱼鳔腔注射PBS，诱导剂处理组对斑马鱼鳔腔分别注射等体积但不同给药浓度的诱导剂；然后，各实验组均加入相同体积的养殖用水，在相同温度下恒温培养；当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，用立体荧光显微镜对斑马鱼鳔位置拍照并保存，对斑马鱼鳔位置聚集的中性粒细胞数量进行定性和定量评价，确定诱导剂的最佳给药浓度；所述诱导剂的给药浓度为1～10mg/mL，所述诱导剂的最佳给药浓度为10mg/mL；(3)构建斑马鱼鳔损伤炎症模型取5dpf的斑马鱼移入微孔板；设置3个实验组：1个为诱导剂处理组，该组中对斑马鱼鳔腔注射10mg/mL的诱导剂，1个为溶剂注射组，该组中对斑马鱼鳔腔注射等体积的PBS；然后，各实验组均加入相同体积的养殖用水，在相同温度下恒温培养；当诱导剂处理斑马鱼至实验终点后，用立体荧光显微镜对斑马鱼鳔位置拍照并保存，对斑马鱼鳔位置聚集的中性粒细胞数量进行统计分析，根据统计学结果，判断已建立了斑马鱼鳔损伤炎症模型。2.根据权利要求1所述的斑马鱼鳔损伤炎症模型的建立方法，其特征在于，所述的养鱼用水条件为：溶解氧质量浓度为6-8mg/L，水温为28℃，pH为7.2-7.6，总硬度为200-250mg/L。3.根据权利要求1所述的斑马鱼鳔损伤炎症模型的建立方法，其特征在于，所述的恒温培养条件为：微孔板置于恒温培养箱中，在28℃下培养4h。4.一种如权利要求1～3任一所述的斑马鱼鳔损伤炎症模型，用于评价肺损伤诱导剂的毒性，所述的诱导剂为能够诱发肺损伤的药物或化学试剂，包括但不限于LPS、PolyI/C。5.根据权利要求4所述的用斑马鱼鳔损伤炎症模型评价肺损伤诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洪翠，柯越海，朱晓宇，张雪，黄燕烽，程洪强，李春启，
申请(专利权)人：杭州环特生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33