一种重组hCREG糖蛋白的新用途及其在冠脉支架上的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及医疗器械领域，具体地说，涉及一种重组hCREG糖蛋白的新用途及其在冠脉支架上的应用，本发明专利技术重组hCREG糖蛋白作为制备抑制炎症和/或抑制动脉粥样硬化的药物组合物中的用途。本发明专利技术不仅能保持现有药物洗脱支架的优势，还能抑制动脉粥样硬化的发展，促进血管再内皮化，对解决现有冠脉支架新生动脉粥样硬化引起的再狭窄及术后需长期服用抗血栓和血小板药物有重要的临床意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及医疗器械领域，具体地说，涉及一种重组hCREG糖蛋白的新用途及其在冠脉支架上的应用。
技术介绍
近二十年来，冠脉支架被广泛用于治疗血管堵塞性疾病。然而支架内再狭窄以及术后长期服药降低了经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的手术获益。如何有效预防并控制再狭窄、改善PCI术后患者的生存质量是广大医务工作者面临的巨大挑战。研究表明，血管内皮功能损伤和血管平滑肌细胞过度增殖/迁移是再狭窄发生的重要环节。因此，装载血管平滑肌细胞增殖抑制剂(雷帕霉素及其类似物、紫杉醇)的药物洗脱支架(drug-elutingstent，DES)是目前临床最常用的冠脉支架。尽管DES的应用有效降低了术后短期内的再狭窄发生率，但研究表明，DES引起的再狭窄进程特点是经历前6个月的稳定期后进入持续的内膜增生、新生动脉粥样硬化进展期，最终削弱了其抗再狭窄的远期疗效。这个过程可能与血管延迟修复、持续炎症反应有关。越来越多的研究发现，动脉粥样硬化斑块中不仅含有脂质，而且有大量炎症细胞浸润，提示了炎症在介导动脉粥样硬化发生、发展过程中可能起重要作用。越来越多的学者开始研究具有生物相容性的蛋白类药物涂层支架，包括装载TNF-α抗体、环状RGD多肽能抑制血管损伤后炎症反应类支架，加速血管内皮化进程的血管内皮生长因子(bFGF和VEGF)释放支架等。其中人E1A激活基因阻遏子(humancellularrepressorofE1A-stimulatedgenes,hCREG)是美国哈佛大学医学院Gill于1998年克隆的小分子量分泌型糖蛋白，该实验室主要研究方向为CREG蛋白对肿瘤细胞分化的影响。前期研究表明CREG蛋白是成熟生物体内维持组织和细胞分化的重要分子，在肿瘤细胞诱导分化和抑制损伤血管VSMCs去分化具有积极的生物学功能。CN102309781A公开了一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架，其表面均匀涂布有重组hCREG糖蛋白，该专利技术所述冠脉支架在植入人体以后，通过支架载带的hCREG糖蛋白成分的持续释放来抑制血管平滑肌细胞增殖，并促进血管壁再内皮化，使损伤血管壁迅速愈合。但其其他的应用目前还未被方向，迄今为止，国内外有关CREG蛋白的研究工作非常有限。
技术实现思路
基于上述已有技术，本专利技术的目的之一在于提供一种重组hCREG糖蛋白的新用途及其在冠脉支架上的应用，其通过抑制炎症反应从而抑制动脉粥样硬化。为达上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种重组hCREG糖蛋白作为制备抑制炎症和/或抑制动脉粥样硬化的药物组合物中的用途。专利技术人发现，目前为止，在现有技术中，并没有公开将重组hCREG糖蛋白应用于抑制炎症和/或抑制动脉粥样硬化中的案例。本专利技术中，重组CREG表达可对抗TNF-α诱导的巨噬细胞炎症反应，而CREG表达下调则可以促进细胞炎症因子分泌。CREG蛋白通过激活自噬抑制TNF-α诱导的细胞炎症反应；CREG蛋白可能通过改变IGFIIR的定位调控溶酶体发生和溶酶体酶的成熟转运。外源性重组CREG蛋白可明显减轻动脉粥样硬化程度，激活自噬，抑制主动脉炎症反应。因此CREG过表达不仅可以抑制VSMCs的表达，促进内皮细胞的迁移和增殖，升高VEGF的表达，对内皮细胞的修复生长有促进作用，同时还能通过抑制炎症从而抑制动脉粥样硬化的进程。因此，新型的重组人源性E1A激活基因阻遏子(humancellularrepressorofE1A-stimulatedgenes,hCREG)生物蛋白洗脱支架通过抑制动脉粥样硬化降低支架内再狭窄。优选地，所述重组hCREG糖蛋白为重组人源性CREG糖蛋白和/或其衍生物。所述重组hCREG糖蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)重组基因载体的构建：用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框，终止密码突变的hCREGRT-PCR引物如下：上游引物为5’-aaggatccatggccgggctatcccgc-3’(SEQIDNO.2)，下游引物为：5’-gcgaattcGcactgaactgtgacattataatattcttctgg-3’(SEQIDNO.3)，其中。大写字母代表C/G突变的终止密码，构建带有his标签蛋白的重组人源性CREG蛋白表达载体pcDNA3.1-his/myc-hCREG；(2)重组人源性CREG蛋白的表达应用lipofectamine2000将pcDNA3.1-his/myc-hCREG转染至人HEK293F细胞中，通过G418抗性筛选稳定表达的HEK293F细胞克隆，收集细胞培养上清液，用Ni-NTA柱纯化和制备重组CREG蛋白；应用Bradford蛋白质定量分析法进行重组CREG蛋白的定量，Westernblot分析进行重组CREG蛋白的定性，考马斯亮兰染色聚丙酰胺凝胶确定重组蛋白纯度；(3)蛋白提纯根据6×His亲和层析原理，应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap脱盐柱脱盐；(4)重组蛋白生物学活性鉴定将纯化的重组CREG蛋白添加于10％血清培养的VSMCs培养基中，用流式细胞仪分析细胞周期观察重组CREG蛋白对VSMCs增殖的影响，鉴定重组CREG蛋白的生物学活性。优选地，所述重组hCREG糖蛋白包含如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。所述重组hCREG糖蛋白的氨基酸序列如下：MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAARVARFVTHVSDWGALATISTLEAVRGRPFADVLSLSDGPPGAGSGVPYFYLSPLQLSVSNLQENPYATLTMTLAQTNFCKKHGFDPQSPLCVHIMLSGTVTKVNETEMDIAKHSLFIRHPEMKTWPSSHNWFFAKLNITNIWVLDYFGGPKIVTPEEYYNVTVQCEFCRYPAQWRPLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH&。优选地，所述药物组合物还包括药物活性组分。优选地，所述药物活性组分包括免疫抑制剂、抗炎药物、抗增殖药物、促再内皮化药物、抗细胞迁移药物或细胞间基质调节剂中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述抗增殖药物包括西罗莫司、他克莫司、艾罗莫司、免疫抑制剂ABT-578、地塞米松、咪唑立宾、雷帕霉素、紫杉醇及其衍生物、放线菌素、长春新碱及其衍生物、他汀类药物、2-氯去氧腺苷、核酶、巴马司他、溴氯哌喹酮或普罗布可中的任意一种或至少两种的组合。第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的用途的重组hCREG糖蛋白制备的冠脉支架，所述冠脉支架表面均匀涂布有重组hCREG糖蛋白。优选地，所述冠脉支架包括药物涂层。优选地，所述药物涂层的药物包括雷帕霉素、紫杉醇及其衍生物、肝素、他克莫司或艾罗莫司中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述药物涂层的药物和重组hCREG糖蛋白直接分布在所述冠脉支架表面或所述冠脉支架表面的纳米孔中。优选地，所述药物涂层的药物和重组hCREG糖蛋白的分布为层层结构或在所述冠脉支架外管腔和所述冠脉支架内管腔两个不同表面分别分布药物层和糖蛋白层。优选地，所述冠脉支架的重组hCREG糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组hCREG糖蛋白作为制备抑制炎症和/或抑制动脉粥样硬化的药物组合物中的用途。

【技术特征摘要】
1.一种重组hCREG糖蛋白作为制备抑制炎症和/或抑制动脉粥样硬化的药物组合物中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重组hCREG糖蛋白为重组人源性CREG糖蛋白和/或其衍生物；优选地，所述重组hCREG糖蛋白包含如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包括药物活性组分；优选地，所述药物活性组分包括免疫抑制剂、抗炎药物、抗增殖药物、促再内皮化药物、抗细胞迁移药物或细胞间基质调节剂中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述抗增殖药物包括西罗莫司、他克莫司、艾罗莫司、免疫抑制剂ABT-578、地塞米松、咪唑立宾、雷帕霉素、紫杉醇及其衍生物、放线菌素、长春新碱及其衍生物、他汀类药物、2-氯去氧腺苷、核酶、巴马司他、溴氯哌喹酮或普罗布可中的任意一种或至少两种的组合。4.一种如权利要求1或2所述的用途的重组hCREG糖蛋白制备的冠脉支架，其特征在于，所述冠脉支架表面均匀涂布有重组hCREG糖蛋白。5.根据权利要求4所述的冠脉支架，其特征在于，所述冠脉支架包括药物涂层；优选地，所述药物涂层的药物包括雷帕霉素、紫杉醇及其衍生物、肝素、他克莫司或艾罗莫司中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述药物涂层的药物和重组hCREG糖蛋白直接分布在所述冠脉支架表面或所述冠脉支架表面的纳米孔中；优选地，所述药物涂层的药物和重组hCREG糖蛋白的分布为层层结构或在所述冠脉支架外管腔和所述冠脉支架内管腔两个不同表面分别分布药物层和糖蛋白层；优选地，所述冠脉支架的重组hCREG糖蛋白和药物涂层不含聚合物载体。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩雅玲，邓婕，孙鸣宇，陈永强，
申请(专利权)人：中国人民解放军沈阳军区总医院，北京乐普医疗科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11