一种免疫层析试纸卡及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种免疫层析试纸卡，包括底板(5)、上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(3)和吸样垫(4)，所述胶体金结合垫(2)为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜(3)为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。本发明专利技术提供的免疫层析试纸卡用于检测杜兴氏肌营养不良疾病的基因突变。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及了一种免疫层析试纸卡、其制备方法和用途，具体而言，本专利技术涉及一种杜兴氏肌营养不良DMD基因突变检测的免疫层析试纸卡，及其制备方法和用途。
技术介绍
DMD又称为杜氏型肌营养不良或假肥大型进行性肌营养不良。所述病症是由位于人X染色体上的肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的突变引起，假肥大型肌营养不良症是神经系统最常见的X连锁隐性遗传病，患者表现为骨骼肌进行性无力、萎缩、小腿腓肠肌假性肥大，分为两种类型。DMD是肌营养不良中发病率最高的一型。还有一种良性亚型，叫BMD(Becker Muscular Dystrophy)，称为贝克型肌肉营养不良。杜兴肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)和贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy，BMD)是最常见的童年形式的肌营养不良。DMD和BMD是由编码肌养蛋白的DMD基因中的基因缺陷引起的。DMD基因是迄今为止发现的最大的人基因，位于Xp21.2-21.3，由79个外显子及其相应的内含子约2.4Mb组成。该基因有时会发生突变，发病情况比较复杂，约有65％左右与遗传有关，35％为个体突变所致。肌养蛋白基因DMD。突变的特征为移码插入、缺失或无义点突变，这导致功能性肌养蛋白的缺乏。BMD突变通常保持可读框完整，从而允许合成具有部分功能性肌养蛋白。肌养蛋白是细胞主链与细胞外基质之间相互作用必需的肌肉蛋白质，从而在收缩期间维持肌纤维的稳定性。肌营养不良蛋白是肌肉组织内的一种对细胞膜的肌营养不良蛋白聚糖复合物(DGC)提供结构稳定性的重要结构组分。肌营养不良蛋白连接内部细胞质肌动蛋白微丝网状结构和细胞外基质，从而对肌肉纤维提供物理强度。因此，改变肌营养不良蛋白或不存在肌营养不良蛋白会导致肌纤维膜功能异常。目前对DMD缺乏有效的治疗，肌营养不良症尚无特效药物和根治方法,包括基因疗法和施用皮质类固醇。这些治疗方法只是延迟某些症状，但不能完全治愈DMD患者。所以检出假肥大型肌营养不良症患者的DMD基因突变并查找出相应的女性携带者是减少或预防假肥大型肌营养不良症患儿出生的有效治疗措施。只能通过对高风险胎儿进行产前诊断,以杜绝患儿的出生。全国每年新增约3000名DMD/BMD病人，患者总数约有10万人。其中新生男婴中1∶3500出现该基因的突变。肌肉活检是能明确诊断是何种DMD基因突变类型，而且能区别是DMD还是BMD，也被作为临床诊断的“金标准”，其缺点具有一定的创伤性。基因检测(多重PCR，MLPA，Sanger测序和高通量测序)虽然能够无创性的并可提供多种信息的检测手段，但检测难度和费用均较大。上述检测方法在生物医学研究及法医学应用实践中存在的突出问题是：只能检出部分突变类型，检出率低，检测周期长；且对人有一定创伤。基因检测虽然检出率高但价格昂贵，普通家庭难以承受。故此，本领域迫切需要建立一种可以一次性检测DMD基因所有突变且快速、简便的筛检方法，以满足临床上产前诊断、种植前诊断的需要。
技术实现思路
本专利技术旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本专利技术的一个目的在于提供了一种用于患有杜兴氏肌营养不良DMD检测试纸卡及其制备方法。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种免疫层析试纸卡，包括底板5、上样垫1、胶体金结合垫2、层析膜3和吸样垫4，其特征在于，上样垫1、胶体金结合垫2、层析膜3和吸样垫4依次粘贴在底板5上，所述胶体金结合垫2为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜3为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。进一步地，所述层析膜3的两端分别搭接有吸样垫4、胶体金结合垫2，所述胶体金结合垫2的另一端搭接有上样垫1，所述上样垫1搭接压住胶体金结合垫2的1/3，所述胶体金结合垫2搭接压住层析垫的1/4，所述吸样垫4搭接压住胶体金结合垫2的1/10，任选地，所述上样垫1为玻璃纤维膜或聚酯膜；任选地，所述吸样垫4为吸水滤纸。进一步地，所述层析膜3上设置有相互平行的检测线T、质控线C且沿着层析膜3的长度方向依次设置，所述检测线T包被DMD抗体，所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。进一步地，所述DMD抗体浓度为0.5-2.5mg/mL。进一步地，所述羊抗鼠IgG抗体浓度为0.8-2.5mg/mL。进一步地，所述硝酸纤维素膜孔径为5-15μm。在本专利技术的第二个部分，本专利技术提供了一种上述免疫层析试纸卡的制备方法，包括以下步骤：胶体金溶液制备：向100ml HauCl4的0.01％水溶液中加入1％柠檬酸三钠水溶液2.00—4.50mL，混匀煮沸，保持沸腾30min得到直径为5-20nm的胶体金溶液；胶体金结合垫制备：将胶体金溶液调至pH7.0-9.0后加入6μg/mL-15μg/mLDMD抗体和封闭剂，10000rpm离心30min，将离心下来的沉淀复溶至含有BSA、蔗糖的胶体金溶液中，将复溶产物加至玻璃纤维膜或聚酯膜后干燥；层析垫制备：将DMD抗体用0.01M，pH为7.4的PBS稀释成0.5mg/mL、1.5mg/mL，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/mL、2mg/mL，检测线T包被DMD抗体，质控线C包被羊抗鼠IgG，然后用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.2μL/cm进行划线包被后干燥；试纸卡组装：将已包被的层析膜3放置在底板5的中部粘贴，在层析膜3的T线一侧搭接胶体金结合垫2，搭胶体金结合垫2的1/4粘贴，在胶体金结合垫2另一侧搭接粘贴上样垫1，搭胶体金结合垫2的1/3粘贴；在层析膜3的C线一侧搭接吸样垫4，搭吸样垫4的1/10粘贴；用裁剪机将贴好的底板5切成3～5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡，任选地，所述封闭剂为1％BSA或0.1％PEG-20000。进一步地，试纸卡组装是在温度为20～25℃，湿度小于30％的室内完成的。在本专利技术的第三个方面，提供了一种免疫层析试剂盒，其包含上述的免疫层析试纸卡。在本专利技术的第四个方面，本专利技术提供了一种检测杜兴氏肌营养不良疾病的基因突变的方法，即使用上述的免疫层析试纸卡或上述的免疫层析试剂盒。本专利技术的有益效果是：(1)根据大约有60-65％的DMD患儿是由于DMD基因外显子缺失所致，5-10％是由于DMD基因外显子重复所致，其余约30％是由于DMD基因微小突变导致。本专利技术对DMD基因的79个外显子、两侧相邻50bp内含子序列和已知位于内含子区突变附近序列设计并合成探针，DMD基因相关致病突变序列进行富集(外显子与内含子突变、包括了点突变和结构重排、已知突变和未知突变)构建蛋白抗体。(2)与现有常规检测方法相比，本专利技术所开发的检测试剂盒能够一次性检测DMD基因各种突变信息，具有全面、快速、准确、价格适中的优点。(3)本专利技术提供的检测DMD的免疫层析试剂盒，采用金标免疫层析技术对DMD抗体进行检测，检测中不需要昂贵的仪器和繁琐的操作过程，简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比基因分析方法缩短了许多。(4)整个检测过程中，样本无需转入其它分析装置，直接滴加实现简易操作，避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。血清、全血、尿液和羊水等多种组织样本，组化定性试验的组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫层析试纸卡，包括底板(5)、上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(3)和吸样垫(4)，其特征在于，上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(3)和吸样垫(4)依次粘贴在底板(5)上，所述胶体金结合垫(2)为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜(3)为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。

【技术特征摘要】
1.一种免疫层析试纸卡，包括底板(5)、上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(3)和吸样垫(4)，其特征在于，上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(3)和吸样垫(4)依次粘贴在底板(5)上，所述胶体金结合垫(2)为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜(3)为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述层析膜(3)的两端分别搭接有吸样垫(4)、胶体金结合垫(2)，所述胶体金结合垫(2)的另一端搭接有上样垫(1)，所述上样垫(1)搭接压住胶体金结合垫(2)的1/3，所述胶体金结合垫(2)搭接压住层析垫的1/4，所述吸样垫(4)搭接压住胶体金结合垫(2)的1/10。3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述层析膜(3)上设置有相互平行的检测线T、质控线C且沿着层析膜(3)的长度方向依次设置，所述检测线T包被DMD抗体，所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。4.根据权利要求1至3任一项所述的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述DMD抗体浓度为0.5-2.5mg/mL。5.根据权利要求1至3任一项所述的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述羊抗鼠IgG抗体浓度为0.8-2.5mg/mL。6.根据权利要求1所述的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述硝酸纤维素膜孔径为5-15μm。7.一种权利要求1所述的免疫层析试纸卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：胶体金溶液制备：向100ml HauCl4的0.01％水溶液中加入1％柠檬酸三钠水溶液2.00—4.50mL，...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡军瑜，王建斌，龚贻洲，周军，曾生，
申请(专利权)人：武汉璟泓万方堂医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42