本发明专利技术公开了一种用于快速鉴别禽多杀性巴氏杆菌致病力的培养基，以及利用该培养基鉴别禽多杀性巴氏杆菌致病力的方法，所述培养基包括脱水小牛脑浸粉、胰蛋白胨、甘油、柠檬酸钠、硫酸锰、硫酸镁、硫酸锌、磷酸氢二钾、卡拉胶、水解乳蛋白、葡萄糖、L‑谷氨酸钠、维生素B6、维生素B12、马血清、鸡红细胞裂解液、纯化琼脂粉和去离子水。所述方法可以直观的进行禽多杀性巴氏杆菌菌种筛选，具有简易、方便、快速等优点。与传统的动物致死性试验相比，减少了实验动物的用量，改善了动物福利，缩短了实验周期。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽医微生物领域，具体涉及一种用于快速鉴别禽多杀性巴氏杆菌致病力的培养基，以及利用该培养基鉴别禽多杀性巴氏杆菌致病力的方法。
技术介绍
禽霍乱是由禽多杀巴氏杆菌引起的一种家禽细菌性传染病。该病广泛流行于世界各地，侵害各种禽类。禽霍乱以出血性败血症为特征，发病禽死亡率高达60％-100％，给养禽业造成较大的危害，多年来一直为国内外所关注，是家禽主要细菌性传染病。目前国内通常采用药物控制的方法减轻疫病的危害，但长期反复用药不仅使饲养成本上升，而且导致细菌耐药性增强以及药物残留等一系列问题，事实证明仅依赖药物控制不是防治禽霍乱的上选对策。相比而言，采用疫苗免疫，既不会造成细菌耐药性增强，也不会产生药物残留，因而更容易被广大养殖者和消费者接受。用于预防禽霍乱的疫苗包括强毒灭活疫苗和弱毒活疫苗，其中强毒灭活疫苗免疫后只能对相同血清型的强毒攻击提供保护，而不能获得对不同血清型菌株的交叉免疫保护力。而弱毒活疫苗接种家禽后，可在体内增殖时产生具有交叉保护作用的抗原——交叉保护因子(cross-protective factor，CPF)，使用弱毒活疫苗具有较广的免疫谱，可以为不同血清型强毒的攻击提供免疫保护，因而备受关注。研制禽霍乱活疫苗的关键是进行弱毒菌株的筛选，即判定菌株的致病性。目前确定禽多杀性巴氏杆菌分离株的致病力主要通过动物致死性试验进行判定，这种方法不仅消耗大量的实验动物，而且费时费力、增加实验成本、违反动物福利，给禽霍乱弱毒活疫苗的研制带来了较大的难度。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种用于快速鉴别禽多杀性巴氏杆菌致病力的培养基，以及利用该培养基鉴别禽多杀性巴氏杆菌致病力的方法。其原理是将禽多杀性巴氏杆菌接种于本专利技术提供的固体培养基，于40℃培养12-15h，在外加斜射光线条件下，通过显微镜观察菌落荧光色彩的差异(强毒菌株呈现橙色荧光，弱毒菌株呈现天蓝色荧光)，进而对菌株的致病性进行快速鉴别。本专利技术提供了一种用于鉴别禽多杀性巴氏杆菌致病性的培养基，其组分为：脱水小牛脑浸粉15-20g/L、胰蛋白胨10-15g/L、甘油5.0-6.0ml/L、柠檬酸钠0.8-1.0g/L、硫酸锰0.3-0.4g/L、硫酸镁0.15-0.2g/L、硫酸锌0.15-0.2g/L、磷酸氢二钾2.5-3.0g/L、卡拉胶0.2-0.3g/L、水解乳蛋白4.0-5.0g/L、葡萄糖10-12g/L、L-谷氨酸钠1.4-1.5g/L、维生素B60.2-0.3g/L、维生素B120.15-0.2g/L、马血清50-60ml/L、鸡红细胞裂解液4.0-5.0ml/L、纯化琼脂粉15g/L，其余为去离子水。制备以上所述的培养基时，需先将脱水小牛脑浸粉、胰蛋白胨、甘油、柠檬酸钠、硫酸锰、硫酸镁、硫酸锌、磷酸氢二钾、卡拉胶、水解乳蛋白、葡萄糖、L-谷氨酸钠、纯化琼脂粉等组分加入去离子水，加热溶解后经氢氧化钠溶液调节PH至7.4，121℃灭菌15min。待冷却至50℃后，加入马血清、鸡红细胞裂解液和过滤除菌的维生素B6与维生素B12溶液，充分混匀后注入平板制成固体培养基。本专利技术的有益效果在于：用本专利技术提供的禽多杀性巴氏杆菌培养基可以直观的进行禽多杀性巴氏杆菌菌种筛选，具有简易、方便、快速等优点。与传统方法相比，减少了实验动物的用量，同时改善了动物福利，缩短了实验周期。研究表明，本专利技术提供的培养基可以使禽多杀性巴氏杆菌菌落具有典型的致病力鉴别特性，即使多次传代后仍可稳定保持菌落原有的荧光鉴别特性。具体实施方式下面的实施例是对本专利技术的进一步详细描述。实施例1取脱水小牛脑浸粉20g、胰蛋白胨10g、甘油5.0ml、柠檬酸钠0.8g、硫酸锰0.3g、硫酸镁0.2g、硫酸锌0.2g、磷酸氢二钾3.0g、卡拉胶0.2g、水解乳蛋白5.0g、葡萄糖12g、L-谷氨酸钠1.5g和纯化琼脂粉15g加入900ml去离子水中，加热至沸腾，并不断搅拌直至混合液完全溶解，用氢氧化钠溶液调节PH值至7.4，121℃灭菌15min。灭菌后待冷却至50℃，分别加入马血清50ml、鸡红细胞裂解液5.0ml、过滤除菌的1％维生素B6溶液20ml(含维生素B60.2g)和1％维生素B12溶液20ml(含维生素B60.2g)，充分混匀后注入灭菌平板，每副平板约15ml，凝固后得到禽多杀性巴氏杆菌培养基。实施例2取脱水小牛脑浸粉15g、胰蛋白胨15g、甘油6.0ml、柠檬酸钠1.0g、硫酸锰0.4g、硫酸镁0.15g、硫酸锌0.15g、磷酸氢二钾2.5g、卡拉胶0.3g、水解乳蛋白4.0g、葡萄糖10g、L-谷氨酸钠1.4g和纯化琼脂粉15g加入900ml去离子水中，加热至沸腾，并不断搅拌直至混合液完全溶解，用氢氧化钠溶液调节PH值至7.4，121℃灭菌15min。灭菌后待冷却至50℃，分别加入马血清60ml、鸡红细胞裂解液4.0ml、过滤除菌的2％维生素B6溶液15ml(含维生素B60.3g)和1％维生素B12溶液15ml(含维生素B60.15g)，充分混匀后注入灭菌平板，每副平板约15ml，凝固后得到禽多杀性巴氏杆菌培养基。实施例3将6株已知致病力的禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株或弱毒菌株接种于按实施例1所述方法制成的禽多杀性巴氏杆菌固体培养基，40℃培养12h后取出，在外加45°斜射光线条件下，通过解剖显微镜观察菌落的荧光色彩，结果显示3株已知为强毒菌株的禽多杀性巴氏杆菌(C48-1、X73和P1059)均呈现橙色荧光，而3株已知为弱毒菌株的禽多杀性巴氏杆菌(CU、P7810和1010)均呈现天蓝色荧光(表1)，与本专利技术的鉴别方法相符。结果表明，使用本专利技术所述的培养基可以通过菌落荧光色彩的差异将强毒菌株和弱毒菌株进行直观的鉴别。表1不同致病力的禽多杀性巴氏杆菌菌落荧光色彩菌株编号来源分离宿主致病力菌落荧光色彩C48-1中国标准株鸡强毒菌株橙色X73国际标准株鸡强毒菌株橙色P1059国际标准株火鸡强毒菌株橙色CU美国疫苗株火鸡弱毒菌株天蓝色P7810中国疫苗株鸭弱毒菌株天蓝色1010中国疫苗株鸡弱毒菌株天蓝色实施例4使用本专利技术所述的方法对234株禽多杀性巴氏杆菌分离株(所有禽多杀性巴氏杆菌分离株均由江苏省家禽科学研究所保存提供，其中鸡源分离株98株，鸭源分离株64株，鹅源分离株61株，火鸡源分离株11株)进行致病力鉴别。将234株分离株接种实施例1所述方法制成的禽多杀性巴氏杆菌固体培养基，40℃培养15h后取出，在外加45°斜射光线条件下，通过解剖显微镜观察菌落的荧光色彩，结果见表2。由表可见，234株禽多杀性巴氏杆菌分离株中菌落荧光色彩为橙色的菌株占96.2％(225/234)，而荧光色彩为天蓝色的菌株仅占3.8％(9/234)，按本专利技术所述的方法判定强毒菌株有225株，弱毒菌株有9株。表2 234株禽多杀性巴氏杆菌分离株菌落分型为了进一步验证本专利技术方法的准确性，从所述234个分离株中选取22株(包括13株强毒株和所有9株弱毒株)。分离株经脑心浸液肉汤增菌后，以1×103菌落形成单位(colonyforming units，CFU)的剂量对3月龄非免疫鸡进行颈部皮下注射攻毒(每个分离株攻毒5只非免疫鸡)，连续观察14天，死本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于快速鉴别禽多杀性巴氏杆菌致病力的培养基，其特征在于：所述培养基含有脱水小牛脑浸粉15‑20g/L、胰蛋白胨10‑15g/L、甘油5.0‑6.0ml/L、柠檬酸钠0.8‑1.0g/L、硫酸锰0.3‑0.4g/L、硫酸镁0.15‑0.2g/L、硫酸锌0.15‑0.2g/L、磷酸氢二钾2.5‑3.0g/L、卡拉胶0.2‑0.3g/L、水解乳蛋白4.0‑5.0g/L、葡萄糖10‑12g/L、L‑谷氨酸钠1.4‑1.5g/L、维生素B6 0.2‑0.3g/L、维生素B12 0.15‑0.2g/L、马血清50‑60ml/L、鸡红细胞裂解液4.0‑5.0ml/L、纯化琼脂粉10‑20g/L，其余为去离子水。
【技术特征摘要】
1.一种用于快速鉴别禽多杀性巴氏杆菌致病力的培养基，其特征在于：所述培养基含有脱水小牛脑浸粉15-20g/L、胰蛋白胨10-15g/L、甘油5.0-6.0ml/L、柠檬酸钠0.8-1.0g/L、硫酸锰0.3-0.4g/L、硫酸镁0.15-0.2g/L、硫酸锌0.15-0.2g/L、磷酸氢二钾2.5-3.0g/L、卡拉胶0.2-0.3g/L、水解乳蛋白4.0-5.0g/L、葡萄糖10-12g/L、L-谷氨酸钠1.4-1.5g/L、维生素B6 0.2-0.3g/L、维生素B12 0.15-0.2g/L、马血清50-60ml/L、鸡红细胞裂解液4.0-5.0ml/L、...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚建森，许明，盛中伟，张萍，左佳坤，张笛，束婧婷，章明，姬改革，徐步，邹剑敏，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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