【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物检测领域，具体涉及一种用于检测肠炎沙门氏菌的新型检测试剂盒及非诊断性检测方法。
技术介绍
1、肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis，se)被确定为食源性沙门氏菌病(也称为胃肠炎)的主要原因，它在国内外导致了明显的发病率、死亡率和经济损失。在临床中，se引起的沙门氏菌病的典型表现包括发热、腹泻、呕吐、偶尔出现侵袭性感染。一般来说，大多数se是通过食用受污染的食物或饮用受污染的水获得，很少在人与人之间传播。因此，从食物来源中及时识别se对于限制对公共卫生的影响至关重要。
2、传统的kauffman-white(k-w)血清型分型作为沙门氏菌亚型方法已有80多年，该方法已鉴定出了2600多种沙门氏菌血清型。然而，传统的血清分型是耗时、不精确和低鉴别能力的。到目前为止，尽管传统的基于实时pcr的食品和环境样本中的se检测方法已经非常有效，但其结果在很大程度上依赖于精确的仪器，训练有素的技术人员伴随着较长的反应周期。环介导等温扩增(lamp)的出现和应用明显克服了基于pcr的se检测方法的缺点，并明显减少了反应时间。然而，需要进一步努力解决lamp的假阳性问题。因此，人们迫切需要一种简单、准确的se检测方法。
3、目前，成簇的规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(crispr/cas)系统为细菌检测提供了一种新的方法。crispr/cas具有显著的生物学特征，包括序列可编程性和顺式切割的特异性，反式切割的信号放大效应，以及相对温和的反应温度，可能是一种重要的现代生物传感器系
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术拟建立一种单管rpa-crispr/cas的se的一步法和一锅法检测系统，忽略冗余的开帽过程，提高检测效率，避免交叉污染。
2、本专利技术的目的是提出一种基于crispr的肠炎沙门氏菌新型核酸检测试剂盒及其方法。为了实现本专利技术的上述目的，拟采用如下技术方案：
3、本专利技术一方面涉及一种基于crispr的肠炎沙门氏菌新型核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括f3引物、b3引物、fip引物、bip引物、lb引物、向导rna、cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述f3引物的核苷酸序列如seq id no.34所示；所述b3引物的核苷酸序列如seq idno.35所示；所述fip引物的核苷酸序列如seq id no.36所示；所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.37所示；所述lb引物的核苷酸序列如seq id no.38所示；所述向导rna的核苷酸序列如seq id no.60所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-fam/tttttttt/bhq1/-3’。
4、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括聚合酶和dntp。
5、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括：缓冲液。
6、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述试剂盒中，每25μl的体系包含：
7、10×lamp缓冲液，2.5μl；
8、dntp，1μl，浓度25mm；
9、mg2+，2μl，浓度100mm；
10、10×lamp引物，2.5μl；
11、甘氨酸，6μl，浓度2m；
12、单链核酸报告分子，1.25μl，浓度10μm；
13、cas12b，2.5μl，浓度10μm
14、bst，1μl，浓度8u/μl；
15、向导rna，2.5μl，浓度10μm；
16、无核酸酶水，1.25μl；
17、待检样本，2.5μl。
18、本专利技术另一方面还涉及一种基于crispr检测肠炎沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：
19、采用上述试剂盒扩增待检样本，测定荧光信号的变化。
20、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述检测的温度为59～61℃，优选为59.5～60.5℃。
21、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述检测方法中的核酸扩增和检测可同步进行，中间不需要开盖。
22、本专利技术将lamp核酸扩增与crispr/cas12b核酸检测结合成一步，建立了一种快速、灵敏、准确的se检测方法。核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。实验结果表明，本专利技术的肠炎沙门氏菌感染检测系统是简单和准确的。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于CRISPR的肠炎沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；所述LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-FAM/TTTTTTTT/BHQ1/-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括聚合酶和dNTP。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括：缓冲液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒中，每25μL的体系包含：
5.一种基于CRISPR检测肠炎沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，所述检测的温度为59～61℃，优选为59.5～
7.根据权利要求5所述的方法，所述检测方法中的核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr的肠炎沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括f3引物、b3引物、fip引物、bip引物、lb引物、向导rna、cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述f3引物的核苷酸序列如seq id no.34所示；所述b3引物的核苷酸序列如seq id no.35所示；所述fip引物的核苷酸序列如seq id no.36所示；所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.37所示；所述lb引物的核苷酸序列如seq id no.38所示；所述向导rna的核苷酸序列如seq id no.60所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-fam/tt...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈海玉，龚建森，盛中伟，张笛，李婷婷，董永毅，许明，吴坤，盛瑜，窦新红，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。