一种鼠伤寒沙门氏菌分子检测试剂盒及非诊断性检测方法技术

技术编号：41092492 阅读：4 留言：0更新日期：2024-04-25 13:52

本发明专利技术涉及微生物检测领域，具体涉及一种用于检测鼠伤寒沙门氏菌的一步法CRISPR/Cas12b检测试剂盒及方法，所述试剂盒包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物、LB引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述LF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述单链核酸报告分子为5’‑/6‑FAM/CCCCCCCC/BHQ1/‑3’或5’‑/6‑FAM/TTTTTTTT/BHQ1/‑3’。本发明专利技术成功开发了一种鼠伤寒沙门氏菌检测试剂盒，采用本发明专利技术的试剂盒进行检测，核酸扩增和检测同步进行，无需开盖检测。

全部详细技术资料下载

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物检测领域，具体涉及一种用于检测鼠伤寒沙门氏菌的crispr检测试剂盒及非诊断性检测方法。

技术介绍

1、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium，st)是一种常见的食源性病原体，它分布广泛，极易通过受污染的食物广泛传播。此外，st是沙门氏菌的主要血清型，导致人类和动物沙门氏菌病，并具有高致病能力。。st被认为是非伤寒沙门氏菌感染暴发的两大优势菌株之一(另一种是肠炎沙门氏菌)。因此，探索和改进st的早期诊断方法，对于阻断食物中毒的广泛爆发、维持生命和财产的安全至关重要。

2、white-kauffman血清分型作为沙门氏菌的亚分型方法已有80年，通过该方法可鉴定出2600多个沙门氏菌血清。然而，这种传统的方法很耗时、不精确、不敏感。目前，一些快速方法已应用于st检测，如免疫层析条、酶联免疫吸附试验(elisa)、聚合酶链反应(pcr)、环介导等温扩增(lamp)等，但这些方法也存在特异性差、耗时、样品预处理复杂、假阳性结果高或成本高的缺点。结果仍然远不能令人满意。因此，人们迫切需要一种快速、灵敏、特异性的st检测方法。

3、目前，成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(crispr/cas)系统提供了一个在细菌检测有前途的方法，由于附带的cas效应(如cas12acas12b和cas13a)，它可以执行旁路切割活动非目标单链rna和dna识别和切割目标序列的特定rna引导的核酸酶。此外，一些基于crispr/cas的平台已被用于核酸分析，包括sherlock(sp

技术实现思路

1、本专利技术的目的是提出一种基于crispr的鼠伤寒沙门氏菌检测试剂盒及其方法。为了实现本专利技术的上述目的，拟采用如下技术方案：

2、本专利技术一方面涉及一种基于crispr的鼠伤寒沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括f3引物、b3引物、fip引物、bip引物、lf引物、lb引物、向导rna、cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述f3引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述b3引物的核苷酸序列如seq idno.3所示；所述fip引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述lf引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述lb引物的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述向导rna的核苷酸序列如seq id no.23所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-fam/cccccccc/bhq1/-3’或5’-/6-fam/tttttttt/bhq1/-3’。

3、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括聚合酶和dntp。

4、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括：缓冲液。

5、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述试剂盒中，每50μl包括：

6、

7、本专利技术另一方面还涉及一种基于crispr检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：

8、采用上述试剂盒扩增待检样本，测定荧光信号的变化。

9、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述检测的温度为56℃～60℃，优选57℃～59℃，更优选57.5℃～58.5℃。

10、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述检测方法中的核酸扩增和检测可同步进行，中间不需要开盖。

11、本专利技术将lamp核酸扩增与crispr/cas12b核酸检测结合成一步，建立了一种快速、灵敏、准确的st检测方法。核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。实验结果表明，本专利技术的鼠伤寒沙门氏菌感染检测系统是简单和准确的。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于CRISPR的鼠伤寒沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物、LB引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述LF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-FAM/CCCCCCCC/BHQ1/-3’或5’-/6-FAM/TTTTTTTT/BHQ1/-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括聚合酶和dNTP。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括：缓冲液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒中，每25μL包括：

5.一种基于CRISPR检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，所述检测的温度为56℃～60℃，优选57℃～59℃，更优选57.5℃～58.5℃。

7.根据权利要求5所述的方法，所述检测方法中的核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。

...

【技术特征摘要】

1.一种基于crispr的鼠伤寒沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括f3引物、b3引物、fip引物、bip引物、lf引物、lb引物、向导rna、cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述f3引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述b3引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述fip引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述lf引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述lb引物的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述向导rna的核苷酸序列如seq id no.23所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-fam/ccccccc...

【专利技术属性】
技术研发人员：许明，龚建森，盛中伟，张笛，董永毅，李婷婷，盛瑜，张萍，吴坤，窦新红，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人